甘油在魔芋膳食纖維固體飲料大腸菌群檢測中的應(yīng)用研究

秦磊磊 胡艷 黃龍 王艷 江一飛 劉恒 韓淑君

摘要?在魔芋膳食纖維固體飲料大腸菌群檢測用稀釋液中添加350 g/L甘油，抑制魔芋葡甘聚糖的凝膠速度，改善檢測過程中樣品稀釋液流動性，確保試驗的順利開展，通過抑菌試驗、對比試驗等方法研究甘油生理鹽水稀釋液檢測大腸菌群的適用性，結(jié)果表明，350 g/L甘油生理鹽水稀釋液對大腸菌群無明顯抑制，甘油生理鹽水稀釋液檢測魔芋膳食纖維固體飲料中大腸菌群有較好的適用性。

關(guān)鍵詞?甘油;魔芋膳食纖維固體飲料;大腸菌群;檢測;適用性

中圖分類號?TS207.4?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）09-0180-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.049

Abstract?350 g/L glycerol was added to the dilution of konjac dietary fiber solid beverage， inhibiting the gel speed of konjac glucomannan， improving the fluidity of the sample diluent during the detection process， ensuring the smooth development of the experiment， and studying the applicability of the glycerol physiological saline diluent to detect coliform bacteria by means of bacteriostatic test and comparative experiment. The results showed that 350 g/L glycerin normal saline diluent had no obvious inhibition on coliform bacteria， and the glycerol saline diluent had better applicability in detecting coliform bacteria in konjac dietary fiber solid beverage.

Key words?Glycerin;Konjac dietary fiber solid drinks;Coliform bacteria;Detection;Applicability

大腸菌群是糞便污染指示菌[1]，是評價食品質(zhì)量衛(wèi)生狀況及安全的重要指標(biāo)，與腸道致病菌有較為密切的關(guān)系[2]，對評價食品安全狀況及食品生產(chǎn)、運輸、儲存環(huán)境評估有重要意義。目前，食品中大腸菌群檢測的方法主要為GB 4789.3—2016[3]，該方法對樣品的稀釋均采用無菌磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，針對特殊樣品未提供適用性更好的稀釋液，魔芋膳食纖維固體飲料具有良好的膠凝性[4]，使用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水稀釋時，樣品稀釋液形成強(qiáng)凝膠致試驗無法正常進(jìn)行，該試驗使用350 g/L甘油-生理鹽水稀釋液[5]延緩樣品稀釋液形成凝膠，以改善試驗效果。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與試劑

魔芋膳食纖維固體飲料;大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.c）CMCC44102，中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心;肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，K.p）CICC10870，中國微生物菌種保藏管理中心;弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii，C.f）CICC10404，中國微生物菌種保藏管理中心;產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes，E.a）CICC10293，中國微生物菌種保藏管理中心;甘油，西隴科技;氯化鈉，西隴科技;PBS緩沖液，賽默飛;平板計數(shù)培養(yǎng)基，海博生物;大腸菌群質(zhì)控樣品，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心。

1.2?試驗設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（LRH-250），廣東韶關(guān)醫(yī)療器械有限公司;滅菌鍋（BXM-50），上海博迅實業(yè)有限公司;生物安全柜（Bio-ⅡA），上海泰事達(dá)機(jī)電設(shè)備有限公司;電子天平（ME2002），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;黏度計（DV2T），美國博勒飛公司。

1.3?試驗方法

1.3.1?菌懸液的制備。

從大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株斜面挑取一環(huán)菌落分別轉(zhuǎn)入100 mL營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24 h，平板計數(shù)法培養(yǎng)24 h測定初始培養(yǎng)液菌濃度，同時劃斜面培養(yǎng)備用，將初始菌液使用生理鹽水稀釋至約為107、105、103 CFU/mL備用。

1.3.2?抑菌效果評價。

用PBS洗取試驗菌24 h新鮮斜面培養(yǎng)物，并稀釋至5.0×105～4.5×106 CFU/mL菌懸液備用。取無菌試管，先加入5.0 mL 350 g/L甘油生理鹽水，再加入0.1 mL試驗用菌懸液，迅速混勻相互作用5 min。分別吸取1.0 mL試驗菌與350 g/L甘油生理鹽水混合液做活菌培養(yǎng)計數(shù)，作為試驗組。同時用PBS代替甘油生理鹽水，進(jìn)行平行試驗，作為陽性對照。取同批次PBS、培養(yǎng)基作陰性對照。試驗重復(fù)3次，計算抑菌率[6]。

1.3.3?加標(biāo)比較試驗。

魔芋膳食纖維固體飲料按照GB 4789.3—2016使用350 g/L甘油生理鹽水稀釋液稀釋，吸取1 mL混合菌懸液接種至上述魔芋膳食纖維固體飲料稀釋液中，進(jìn)行大腸菌群檢測;使用無菌生理鹽水替代樣品，以生理鹽水為稀釋液作為參比對照，檢測結(jié)果取對數(shù)，每個接種水平進(jìn)行6次平行試驗[7]。

1.3.4?協(xié)同試驗。

協(xié)同試驗采用質(zhì)控樣品污染無菌膳食纖維固體飲料基體的方式在不同實驗室中展開，按照說明書對質(zhì)控樣品水化，將185 mL 425.5 g/L甘油-生理鹽水稀釋液與40 mL水化液合并混勻，加入基體充分混勻，此為樣品原液，進(jìn)行大腸菌群檢測，菌落數(shù)總量=樣品原液菌濃度（CFU/mL）×225（mL）。

2?結(jié)果與分析

2.1?抑菌效果評價

使用大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌作為試驗菌評價350 g/L甘油生理鹽水稀釋液的抑菌效果，根據(jù)表1結(jié)果顯示，菌落總數(shù)陽性對照與試驗組差異不大，抑菌率均遠(yuǎn)小于50%，表明350 g/L甘油-生理鹽水改良稀釋液對4種典型受試菌無明顯抑制作用。曾愛兵等[8]使用40%甘油小牛血清保存大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌，12個月后仍有良好的生物學(xué)性狀且反復(fù)凍融仍無影響，表明一定濃度的甘油對大腸菌群基本無抑制作用。

2.2?加標(biāo)比較試驗

對102～104 CFU/g接種水平下使用改良稀釋液和生理鹽水結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗分析[9]，結(jié)果顯示（表2），102、103、104 CFU/g不同接種水平下，配對t檢驗P值分別為0.16、0.23和0.11，說明使用改良稀釋液與生理鹽水檢測時不存在顯著差異。

2.3?協(xié)同試驗

協(xié)同試驗在6家實驗室中展開，考核使用350 g/L甘油-生理鹽水稀釋液檢測大腸菌群結(jié)果與特性值的一致性。結(jié)果顯示（表3），6家實驗室結(jié)果均在特性值區(qū)間范圍內(nèi)，符合質(zhì)量控制要求，稀釋液中添加350 g/L甘油對質(zhì)控樣品檢測結(jié)果影響不大。

3?結(jié)論

350 g/L甘油-生理鹽水稀釋液與生理鹽水稀釋液檢測大腸菌群結(jié)果無顯著性差異，不同實驗室協(xié)同試驗結(jié)果均在特性值區(qū)間內(nèi)，抑菌效果評價也表明350 g/L甘油生理鹽水對大腸菌群無明顯的抑制作用，同時此甘油濃度稀釋液可有效延緩檢驗中凝膠的形成，對檢測魔芋膳食纖維固體飲料中大腸菌群有一定的適用性，因魔芋膳食纖維固體飲料樣品特殊，無法嚴(yán)格與標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對，對比試驗結(jié)果可能存在一定誤差，同時為完整的方法學(xué)研究帶來了困難，針對此樣品大腸菌群檢驗的方法學(xué)研究有待進(jìn)一步探討[10]。

參考文獻(xiàn)

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[6] 中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會.抗菌和抑菌效果評價方法：WS/T 650—2019[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2019.

[7] 雷質(zhì)文.食品微生物實驗室質(zhì)量管理手冊[M].2版.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018：105-122.

[8] 曾愛兵，陳增強(qiáng)，杜季梅.小牛血清甘油低溫保存菌種方法介紹[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004，31（4）：610-611.

[9] 劉秀梅，盧行安，顧其芳，等.AOAC 991.14 PetrifilmTM大腸菌群測試片法與GB4789.3大腸菌群計數(shù)法的比較研究[J].中國食品學(xué)報，2010，10（6）：167-172.

[10] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.食品微生物檢驗方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范：SN/T 3266—2012[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.