球孢白僵菌在牛蒡苗期的定殖研究

查錦宏 蒙怡 朱蘊(yùn)蘭 邵穎 陳安徽 張愛文 曹陽 岳明宇 朱文靜

摘要?為研究球孢白僵菌在牛蒡苗中的定殖情況，采用浸種法、灌根法處理牛蒡種子，種植后每隔7 d取牛蒡苗采用組織研磨涂布法檢測球孢白僵菌在牛蒡苗中的定殖情況，研究球孢白僵菌在牛蒡苗不同組織中的分布狀況與定殖規(guī)律。結(jié)果表明，灌根和浸種法均能將球孢白僵菌成功定殖于牛蒡苗中，但浸種法優(yōu)于灌根法。灌根處理7 d時(shí)，牛蒡苗中未檢測出球孢白僵菌，14 d時(shí)牛蒡苗根、莖、葉中球孢白僵菌定殖量達(dá)最大值，隨后隨著時(shí)間的延長定殖量逐漸降低;浸種處理組在出苗第7 天時(shí)即有球孢白僵菌定殖，隨后定殖量下降，在第28天時(shí)定殖量又升高;牛蒡種子浸種72 h處理后種植，球孢白僵菌定殖效果優(yōu)于浸種48 h處理，第28天時(shí)72 h浸種組牛蒡苗根、莖、葉中球孢白僵菌定殖量較48 h浸種組分別高 34.18%、51.79%和29.66%。

關(guān)鍵詞?球孢白僵菌;牛蒡;苗期;定殖

中圖分類號(hào)?S482.3?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2021）09-0141-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.036

Abstract?In order to clarify the colonization of Beauveria bassiana in the roots and stems of burdock seedling，soaking and root-irrigation methods were used to detect the colonization of Beauveria bassiana in the burdock seedlings.The result showed that Beauveria bassiana could be successfully colonized in the burdock seedlings，soaking method was better than root-irrigation.There was no Beauveria bassiana in seedling of burdock at the 7 d.The colonization amount of Beauveria bassiana at the 14 d was up to the highest level，and then，the Beauveria bassiana amount was decreased.In the soaking treatment group，Beauveria bassiana started to colonized in burdock seedling，then the colonization amount decreased，and then increased at 28 d.After soaking seeds of burdock for 72 h，the colonization effect was better than that of for 48 h.The colonization amount of Beauveria bassiana in the root，stem and leaf of burdock seedling of 72 h soaking treatment group were 34.18%，51.79% and 29.66% higher than that of 48 h soaking treatment group.

Key words?Beauveria bassiana;Burdock;Seedling stage;Colonization

牛蒡（Arctium lappa）又名大力子、東洋參、東洋牛鞭菜等，屬菊科2年生大型草本植物，是藥菜兼用植物，具有較高的食用及保健價(jià)值[1-3]。研究顯示，牛蒡葉提取物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用;牛蒡子提取物具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、利尿、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂及對熱休克反應(yīng)的抑制活性[4-9];牛蒡根提取物能明顯降低高脂大鼠的總膽固醇及甘油三酯水平，升高高密度脂蛋白膽固醇水平[10];牛蒡子和牛蒡根對治療HIV也有一定的作用[11]。因此，牛蒡及牛蒡產(chǎn)品的消費(fèi)量日益增加，牛蒡種植及加工產(chǎn)業(yè)已成為牛蒡主產(chǎn)區(qū)的重點(diǎn)發(fā)展產(chǎn)業(yè)。牛蒡種植過程中會(huì)受到病蟲害的危害，常見病害有黑斑病、角斑病、白粉病、莖腐病、炭疽病、枯萎病、花葉病等，其中黑斑病、白粉病、莖腐病是牛蒡主要病害，嚴(yán)重影響牛蒡的產(chǎn)量及品質(zhì)。傳統(tǒng)的防治牛蒡病害的方法主要是化學(xué)方法。但隨著人們對食品質(zhì)量安全的重視，特別是國外對進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)要求的提高，使用化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害受到了極大的限制，嚴(yán)重制約了牛蒡的生產(chǎn)。尋找高效的生物防治手段防治牛蒡病害將是牛蒡無公害生產(chǎn)及其產(chǎn)業(yè)持續(xù)性發(fā)展的重要保障。

球孢白僵菌（B.bassiana）是可以導(dǎo)致昆蟲白僵病的一種真菌，是生物防治中最重要的種類[12-13]。目前已被開發(fā)用于真菌殺蟲劑，并被廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)林害蟲并產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益，研究顯示蟲生真菌在植物組織定殖與植株的抗病能力直接相關(guān)[14-16]。筆者采用不同接種方式接種球孢白僵菌，考察了球孢白僵菌在牛蒡苗期的定殖情況，為球孢白僵菌在作物抗病方面的應(yīng)用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

1.1.1?試驗(yàn)樣品。牛蒡種子購于河南豐登種業(yè)有限公司。球孢白僵菌菌株保存于徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2?儀器設(shè)備與試劑。

儀器設(shè)備：梅特勒AE200型電子天平，上海分析儀器廠;SENCO R-502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)公司;數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋HH-4，國華電器有限公司;超純水系統(tǒng)，PALL Cascada LS 頗爾公司;可調(diào)高速勻漿機(jī)FSH-2A，金壇市華城潤華實(shí)驗(yàn)儀器廠;生物顯微鏡BM2000，江南永新光學(xué)有限公司;真空冷凍干燥機(jī)?LGJ-10，上海比朗儀器有限公司;超低溫冰箱?MDF594，日本SANYO電子有限公司;渦旋混勻器HYQ-3111，美國精騏有限公司。

試劑：葡萄糖，上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇，徐州師范大學(xué)科技開發(fā)總公司化工廠;過氧化氫，天津市福晨化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠;吐溫80，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3?培養(yǎng)基。SDAY培養(yǎng)基：蛋白胨1 %、酵母浸膏1 %、瓊脂2 %、葡萄糖4 %。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?球孢白僵菌的培養(yǎng)及孢懸液的制備。

將球孢白僵菌接種于SDAY培養(yǎng)基并于25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后刮取球孢白僵菌孢子于0.05% 的Tween-80水溶液，充分振蕩后再使用無菌水配制成濃度為1×108 CFU/mL的球孢白僵菌孢懸液，備用。

1.2.2?浸種與種植。

選取顆粒大小均一的牛蒡種子，先用無菌水沖洗后再用70% 的乙醇溶液進(jìn)行表面消毒2～3 min，之后使用無菌水沖洗幾遍，再用2% 的氫氧化鈉溶液進(jìn)行表面消毒，最后再用無菌水沖洗。晾干后，每100粒牛蒡種子浸泡在20 mL濃度為1×108 CFU/mL的孢子懸浮液中，25 ℃、120 r/min條件下浸種。浸種48 h處理的設(shè)置為48 h處理組;浸種72 h處理的設(shè)置為72 h處理組;另設(shè)對照組CK1和CK2，用0.05% 的Tween-80的水溶液浸種48和72 h的處理組分別設(shè)置為CK1和CK2處理組。種子處理后于無菌條件下自然風(fēng)干。沙土高壓蒸汽滅菌后裝入無菌花盆，將處理好的牛蒡種子播種于花盆并在表層覆蓋一層約1 cm的滅菌土，澆適量的無菌水。

1.2.3?灌根。

將表面消毒后的牛蒡種子隨機(jī)分為灌根處理組和空白對照CK3組，2組播種于盛放無菌土的花盆中。待種植后的第7天，灌根組用50 mL濃度為 1×108 CFU/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液灌根處理;CK3組用0.05% 的吐溫-80水溶液灌溉牛蒡苗。

1.2.4?定殖量檢測。

經(jīng)浸種和灌根處理的牛蒡待出苗后的第7、14、21、28天取苗，隨機(jī)剪取牛蒡苗的根、莖、葉各1 g于研缽中，加入2 mL 0.05% 吐溫-80溶液并采用研磨法研磨牛蒡苗的根、莖、葉組織，勻漿液進(jìn)行梯度稀釋后采用涂布法涂布于SDAY平板培養(yǎng)基中，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)后記錄各植物組織中球孢白僵菌的數(shù)量，并計(jì)算球孢白僵菌在1 g牛蒡苗組織中的數(shù)量。

2?結(jié)果與分析

2.1?球孢白僵菌在牛蒡根中的定殖量

采用灌根和浸種的方法接種球孢白僵菌孢懸液，檢測牛蒡出苗不同時(shí)期牛蒡苗根中球孢白僵菌的數(shù)量，結(jié)果見表1。

由表1可知，3組空白對照組均未檢測到球孢白僵菌。在牛蒡出苗第7天時(shí)，灌根組的牛蒡根際未檢測到球孢白僵菌。浸種48和72 h組的牛蒡苗根中球孢白僵菌的菌落數(shù)顯著高于出苗后期，而浸種72 h組在牛蒡苗根部的定殖量比浸種48 h組高22.92%。浸種處理組隨著出苗時(shí)間的延長球孢白僵菌在根中的定殖量不斷減少，但在第28天時(shí)又有所增加，但灌根組根中球孢白僵菌的定殖量隨著出苗時(shí)間的延長逐漸減少。比較3個(gè)試驗(yàn)組牛蒡苗中球孢白僵菌的定殖量，浸種72 h更有利于球孢白僵菌在牛蒡苗根中的定殖。

2.2?球孢白僵菌在牛蒡苗莖中的定殖量

采用灌根法和浸種法處理牛蒡種子，待牛蒡出苗后測定出苗不同時(shí)期牛蒡不同組織中球孢白僵菌的定殖量，結(jié)果見表2。

由表2可知，空白對照組牛蒡苗莖中始終未有球孢白僵菌。出苗第7天時(shí)，灌根組的牛蒡苗莖中也未檢測到球孢白僵菌，這與根中球孢白僵菌定殖特征相似;在出苗第14天時(shí)球孢白僵菌定殖量達(dá)到最大，但隨后隨著時(shí)間的延長定殖量逐漸減少。第7天時(shí)，浸種72 h組的牛蒡苗莖中球孢白僵菌的定殖量顯著高于浸種48 h組，高出16.92%;浸種48和72 h組牛蒡苗莖中定殖量呈先下降后上升的趨勢，在出苗第28天時(shí)，灌根組和浸種72 h組牛蒡苗莖中定殖量顯著高于浸種48 h組，灌根組與浸種72 h組間雖無顯著差異，但浸種72 h組定殖量高于灌根組。綜合比較3個(gè)試驗(yàn)組牛蒡苗中球孢白僵菌的定殖量，浸種72 h組優(yōu)于其他試驗(yàn)組。

2.3?球孢白僵菌在牛蒡苗葉中的定殖量

采用“1.2.4”的試驗(yàn)方法檢測灌根和浸種處理牛蒡種子后牛蒡苗葉中球孢白僵菌的定殖量，具體試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，球孢白僵菌在牛蒡苗葉中的定殖規(guī)律與在根、莖中的一致，牛蒡出苗后，浸種72 h組牛蒡苗葉中球孢白僵菌的定殖量顯著高于48 h組，但2個(gè)試驗(yàn)組中牛蒡葉中定殖量均呈先降低后升高的趨勢，在第28天時(shí)72 h浸種組牛蒡葉中定殖量比48 h浸種組高29.66%。灌根組在牛蒡出苗第14天時(shí)才檢測到葉中的球孢白僵菌，隨后隨著時(shí)間的延長定殖量逐漸下降。綜合比較3個(gè)試驗(yàn)組牛蒡苗葉中球孢白僵菌的定殖量，浸種72 h更有利于球孢白僵菌的定殖。

3?結(jié)論

在牛蒡出芽期間采用浸種處理和灌根處理接種球孢白僵菌，研究球孢白僵菌在牛蒡苗根、莖、葉中的定殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌根處理和浸種處理均能夠成功將球孢白僵菌定殖在牛蒡苗中，浸種處理較灌根處理更有利于球孢白僵菌的定殖。灌根處理組牛蒡在出苗第7天時(shí)沒有球孢白僵菌定殖，但浸種處理組已成功定殖。灌根處理組在出苗第14天時(shí)球孢白僵菌定殖量達(dá)到最大值，且高于浸種處理組，隨后定殖量逐漸降低;浸種處理48和72 h組，球孢白僵菌在牛蒡苗根、莖、葉中的定殖規(guī)律相同，均呈定殖量先降低再上升的趨勢。浸種72 h組在不同時(shí)期的球孢白僵菌定殖量顯著高于48 h組，因此，采用浸種方式且浸種72 h更有利于球孢白僵菌在牛蒡苗期的定殖。

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