棘胸蛙染色體核型分析

龍嘉航 侯金亮 周文 向建國 潘望城

摘要?[目的]為棘胸蛙的細(xì)胞遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，并為棘胸蛙的遺傳組成分析提供理論參考。[方法]以湖南省石門棘胸蛙為試驗(yàn)材料，腹腔注射秋水仙素，取其骨髓細(xì)胞，進(jìn)行低滲、固定，采用空氣干燥法制片，吉姆薩染液染色，觀察棘胸蛙染色體核型和特征。[結(jié)果]棘胸蛙染色體數(shù)目為2n=26，占所觀察分裂相總數(shù)的88.33%;核型公式為2n=26（4sm+9m），沒有發(fā)現(xiàn)隨體和次縊痕。[結(jié)論]湖南石門棘胸蛙沒有異形性染色體。棘胸蛙染色體核型存在地域差異（種間差異）。

關(guān)鍵詞?棘胸蛙;染色體;核型

中圖分類號?S917.4?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）09-0095-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.024

Abstract?[Objective] To lay the foundation for the cytogenetic research of Quasipaa spinosa and provide theoretical references for the genetic composition analysis of Q. spinosa.[Method] Q. spinosa in Shimen of Hunan Province was used as test materials to make intraperitoneal injection of colchicine. The bone marrow cells were collected to make hypotonic treatment and fixation. The slices were prepared by using air-drying method and stained by Giemsa staining method.The chromosome karyotype and characteristics of Q. spinosa were observed. [Result] The chromosome number of Q. spinosa?was?2n=26，which took 88.33% of all observed mitotic metaphases.The karyotypic formula of Q. spinosa was 2n=26（4sm+9m）.No satellite or?subconstriction was found. [Conclusion] There was no heteromorphic sex chromosome in Q. spinosa in Shimen of Hunan Province. The karyotype of Q. spinosa had regional differences（interspecies differences）.

Key words?Quasipaa spinosa;Chromosome;Karyotype

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）隸屬兩棲綱無尾目新蛙亞目叉舌蛙科棘蛙屬，其中大多數(shù)種確認(rèn)分布在中國和越南[1]。棘胸蛙是流水穴居生活型蛙類，喜靜怕噪，常晝伏夜出[2]。棘胸蛙自然資源日益減少，目前被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（International Union for the Conservation of Nature，IUCN）紅色名錄和中國物種紅色名錄定為易危物種[3-4]。棘胸蛙肉質(zhì)鮮嫩，必需氨基酸含量高，具有強(qiáng)壯滋補(bǔ)的藥用價(jià)值，其市場前景廣闊。

染色體是遺傳信息的載體，研究兩棲類的染色體，對于探討兩棲類的遺傳、變異及進(jìn)化具有一定的意義[5-6]。目前，國內(nèi)外對棘胸蛙的研究主要圍繞種質(zhì)資源調(diào)查[7-8]、功能基因克隆[9-10]、疾病[11-12]等方面。許多學(xué)者對不同地理居群的棘胸蛙進(jìn)行了染色體核型分析，未發(fā)現(xiàn)雌雄間存在核型差異[13-15]。

筆者采用骨髓細(xì)胞冷滴片法，比較了湖南石門縣棘胸蛙雌雄個(gè)體的染色體核型，以期豐富棘胸蛙細(xì)胞遺傳學(xué)信息，并為棘蛙屬系統(tǒng)演化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用棘胸蛙均于2019年12月13日在湖南漁欣味農(nóng)業(yè)科技有限公司石門縣石蛙養(yǎng)殖場采集。選取體形勻稱、健康、活力好、性成熟的雌、雄棘胸蛙各5只，成熟雄蛙胸部具有黑色刺疣，成熟雌蛙腹部光滑，體重為70～100 g。

1.2?染色體標(biāo)本的制備

將棘胸蛙在試驗(yàn)前停止投喂，在20 ℃左右環(huán)境下暫養(yǎng)3 d。于蛙腹腔注射秋水仙素，劑量為10 μg/g（蛙體重）。注射秋水仙素4 h后采用雙毀髓法（延髓和脊髓）處死棘胸蛙。將股骨和腿肌肉分離，取股骨，剪去骨頭兩端，使用0.65%生理鹽水反復(fù)沖洗骨髓至燒杯中。用鑷子夾碎骨髓，吸取燒杯中的上清液至1.5 mL離心管中（注意不要吸取雜質(zhì)），離心并棄去上清液，加入1.5 mL的0.34%KCl，混勻。37 ℃下水浴低滲30 min。離心得到沉淀物后加入0.3 mL固定液，輕輕彈散打勻沉淀，37 ℃下放置10 min，離心后棄去上清液。往離心管中加入1.5 mL卡諾氏固定液（甲醇∶乙醇=3∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用）固定3次（10、15、15 min），固定后離心，棄去固定液。4 000 r/min，離心5 min。

往離心管中加入少量固定液，用200 μL移液槍將離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀吹散打勻，直至呈白色云霧狀，在預(yù)冷載玻片滴片。玻片自然晾干后，用吉姆薩染液染色30 min后取出，用超純水沖去浮色。

1.3?核型分析

通過顯微鏡觀察，并選取分散良好的分裂相進(jìn)行拍照保存（1 000倍）。雌雄個(gè)體各選55個(gè)良好的中期分裂相進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。對分裂相中各染色體的長臂、短臂進(jìn)行測量，計(jì)算染色體的相對長度和臂比值，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。參照Levan等[16]的標(biāo)準(zhǔn)對染色體進(jìn)行命名和劃分，大型染色體的相對長度大于8%，小型染色體的相對長度小于7%。相對長度=單個(gè)染色體長度/染色體組總長×100%，臂比值=長臂長/短臂長。

2?結(jié)果與分析

經(jīng)鏡檢共發(fā)現(xiàn)60個(gè)染色體分散良好的分裂相，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，染色體數(shù)目為26的有55個(gè)，占比88.33%，故確定棘胸蛙染色體數(shù)目2n=26（表1）。石門縣棘胸蛙個(gè)體體細(xì)胞的染色體眾數(shù)均為26，有13對染色體，分別由5對大染色體和8對小染色體組成，無隨體和次縊痕。將它們按大小排序，見圖1～2。

雌雄各選取10個(gè)數(shù)目完整、形態(tài)清晰的中期分裂相進(jìn)行觀察和測量，并計(jì)算其相對長度和臂比，結(jié)果見表2。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，可將棘胸蛙核型分為3組：①A組（No.1）。No.1為棘胸蛙染色體中最大的一對中部著絲粒染色體。②B組（No.2～5）。No.2、4為亞中部著絲粒染色體，No.3為中部著絲粒染色體。③C組（No.6～13）。此8對染色體相對長度較小，No.8、10為亞中部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，No.13為相對長度最小的一對染色體。No.1～5為大型染色體，No.6～13為中小型染色體。湖南石門縣棘胸蛙核型公式為2n=26（4sm+9m）;未發(fā)現(xiàn)異形性染色體、隨體和次縊痕（圖1）。

3?討論

兩棲動(dòng)物在脊椎動(dòng)物中具有“承上啟下”的進(jìn)化地位。據(jù)報(bào)道，我國已有100多種兩棲類染色體核型的研究資料[17];國外有1 000多種兩棲類的染色體核型被研究分析，且超過96%的兩棲動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)異形性染色體[18]。不適當(dāng)?shù)那锼伤貪舛群吞幚頃r(shí)間會導(dǎo)致染色體標(biāo)本效果差[19]。該研究通過參考一些無尾目物種的染色體標(biāo)本制備方法[20-21]，確定合適的秋水仙素的處理時(shí)間與濃度等試驗(yàn)條件。

石門縣棘胸蛙核型公式為2n=26（4sm+9m），這與吳昌謀等[15]報(bào)道的廣西資源縣棘胸蛙的核型公式相一致，但與其3、6、9號染色體為亞中部著絲粒染色體類型不一致;這與鄭秀梅等[14]報(bào)道的福建省福州市郊區(qū)棘胸蛙核型中的3、6、9、12號染色體為亞中部著絲粒染色體不一致;這與李炳華等[13]報(bào)道的安徽黃山及九華山棘胸蛙核型中3、9號染色體為亞中部著絲粒染色體不一致。

迄今為止，棘屬中已進(jìn)行核型分析并進(jìn)行雌雄核型比較的約20種，且并未發(fā)現(xiàn)異形性染色體。兩棲動(dòng)物性染色體同形性可能是由高頻轉(zhuǎn)換、偶然重組、染色體重排等機(jī)制維持[22]。棘蛙屬物種間核型數(shù)目變化較大，以2n=26為主（表3）。棘蛙屬分支內(nèi)物種染色體數(shù)目增多，可能是由著絲點(diǎn)分離所致。染色體數(shù)目多，具有較多端部著絲粒和小染色體的核型是兩棲類原始核型狀態(tài)，2n=26可能是高等無尾類的原始核型[23]。無聲囊棘蛙和雙團(tuán)棘胸蛙擁有特殊的2n=64，且全部為t型染色體。此核型是否為迄今發(fā)現(xiàn)最原始的核型，還是次生分離導(dǎo)致并未確定。從現(xiàn)有資料來看，棘肛蛙2n=40很可能是棘蛙屬次生分離過程中2n=26到2n=64的過渡物種，具有2條t型染色體。棘蛙屬可能存在更多的過渡核型尚未發(fā)現(xiàn)。

通過比較湖南、廣西、福建、安徽等地的棘胸蛙核型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棘胸蛙核型存在地理差異。導(dǎo)致核型地理差異的原因有3種：①種內(nèi)核型多態(tài)化現(xiàn)象，可能是由遺傳多樣性所致;②棘胸蛙活動(dòng)空間小，由于地理緯度的不同，出現(xiàn)地理隔離之后種群間基因交流減少，加上不同環(huán)境條件的影響，使得不同地區(qū)的棘胸蛙核型出現(xiàn)差異分化;③目前研究的技術(shù)水平局限和差別所致。通過對棘蛙屬不同物種以及不同地理類群間的分析比較，探究其染色體分化因素，對于完善兩棲類核型進(jìn)化理論上具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] XIANG J G，HE T Y，WANG P P，et al.Opportunistic pathogens are abundant in the gut of cultured giant spiny frog（Paa spinosa）[J].Aquaculture research，2018，49（5）：2033-2041.

[2] 彭英海，周先文，熊鋼，等.棘胸蛙的繁殖及生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J].江西水產(chǎn)科技，2017（1）：47-48.

[3] CHAN H K，SHOEMAKER K T，KARRAKER N E.Demography of Quasipaa frogs in China reveals high vulnerability to widespread harvest pressure[J].Biological conservation，2014，170：3-9.

[4] LONG J H，XIANG J G，HE T Y，et al.Gut microbiota differences during metamorphosis in sick and healthy giant spiny frogs（Paa spinosa）tadpoles[J].Letters in applied microbiology，2020，70（2）：109-117.

[5] FLAMENT S.Sex reversal in Amphibians[J].Sexual development，2016，10（5/6）：267-278.

[6] JEFFRIES D L，LAVANCHY G，SERMIER R，et al.A rapid rate of sex-chromosome turnover and non-random transitions in true frogs[J].Nature communications，2018，9（1）：1-11.

[7] 詹忠根，劉悅，黃偉素，等.棘胸蛙種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32（2）：77-81.

[8] 張小偉，周昌和.龍泉市野生棘胸蛙資源現(xiàn)狀調(diào)查與保護(hù)對策[J].華東森林經(jīng)理，2016，30（2）：38-41.

[9] 徐學(xué)清，劉文君.雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的基因克隆及活性檢測[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（2）：237-241.

[10] HU W F，DONG B J，KONG S S，et al.Pathogen resistance and gene frequency stability of major histocompatibility complex class IIB alleles in the giant spiny frog Quasipaa spinosa[J].Aquaculture，2017，468：410-416.

[11] LEI X P，YI G，WANG K Y，et al.Elizabethkingia miricola infection in Chinese spiny frog（Quasipaa spinosa）[J].Transboundary and emerging diseases，2019，66（2）：1049-1053.

[12] 李明，宋婷婷，鄭榮泉，等.棘胸蛙歪頭病病原分離·鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（3）：64-66，98.

[13] 李炳華，汪尊德.棘胸蛙的染色體組型分析[J].遺傳，1983，5（5）：39-41.

[14] 鄭秀梅，洪怡莎.虎紋蛙（Rana tigrinarugulosa Wiegmann）棘胸蛙（Rana spinosa David）的染色體組型[J].四川動(dòng)物，1984，3（2）：33-36.

[15] 吳昌謀，陳志堅(jiān)，王秉新.桂林棘胸蛙染色體的組型[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1990，8（1）：73-77.

[16] LEVAN A，F(xiàn)REDGA K，SANDBERG A A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J].Hereditas，1964，52（2）：201-220.

[17] 龐啟平，葉英，溫業(yè)棠.中國兩棲動(dòng)物染色體研究名錄[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2002，37（4）：49-62.

[18] EGGERT C.Sex determination：The amphibian models[J].Reproduction，nutrition，development，2004，44（6）：539-549.

[19] 梁述章，宋煒，蔣科技，等.棘頭梅童魚染色體核型分析[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2019，40（4）：172-177.

[20] 高文，林芳.福建寧德澤陸蛙染色體組型與銀染的研究[J].寧德師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，26（3）：259-262.

[21] CHANG S P，MA G C，CHEN M，et al.Species and sex comparisons of karyotype and genome size in two Kurixalus tree frogs（Anura，Rhacophoridae）[J].Acta herpetologica，2017，12（2）：139-150.

[22] 龍嘉航，張濃，謝新民，等.兩棲動(dòng)物性染色體的多樣性及其進(jìn)化機(jī)制的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2020，55（4）：532-539.

[23] 李樹深.兩棲動(dòng)物的染色體及其演化[J].動(dòng)物學(xué)雜志，1991，26（2）：47-52.

[24] 陳文元，王子淑，王喜忠，等.四川六種蛙染色體組型的比較研究[J].動(dòng)物學(xué)研究，1983，4（1）：83-88.

[25] 李樹深，胡健生.中國幾種棘蛙的核型C-帶和Ag-NORs研究[J].動(dòng)物學(xué)研究，1996，17（1）：84-88.

[26] 張加一，谷曉明.水城棘腹蛙的核型和Ag-NORs研究[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1997，15（2）：48-51.

[27] 李樹深，胡健生.福建九龍棘蛙和小棘蛙的核型和Ag-NORs研究[J].動(dòng)物學(xué)雜志，1995，30（5）：11-14.

[28] 高建民，葉冰瑩，蔡明章.九龍棘蛙和棘胸蛙的染色體比較研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1991，7（4）：84-89.

[29] 李樹深，胡健生.云南三種同域分布的棘蛙（蛙科Ranidae：無尾目Anura）的核型和銀帶研究[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，1994，40（3）：317-323.

[30] 譚安鳴，吳貫夫.棘蛙群三種的核型及其染色體演化的初步探討[J].兩棲爬行動(dòng)物學(xué)報(bào)，1987，6（4）：38-39.

[31] 陳曉虹，夏中榮，陶立奎，等.3種隆肛蛙的核型分析[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，34（4）：151-153.

[32] 楊玉華，趙爾亦，高正發(fā).隆肛蛙的染色體組型[J].兩棲爬行動(dòng)物學(xué)報(bào)，1986，5（4）：251-253.

[33] 劉萬國，昝瑞光.蛙屬中的一個(gè)特殊核型——雙團(tuán)棘胸蛙的核型及其C帶和銀帶的研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，1984，11（1）：61-64.

[34] 吳貫夫，趙爾必.無尾類中一種罕見的核型-雙團(tuán)棘胸蛙Rana Phrynoides的染色體組型[J] .兩棲爬行動(dòng)物學(xué)報(bào)，1984，3（1）：29-32.