廣東梅州客家人群甲狀腺癌BRAF基因V600E突變特點分析

曾慶欣?饒輝?王悅冬?賴燁鈐?鐘海烽

【摘要】目的 探討廣東梅州客家人群甲狀腺癌鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 （BRAF）基因V600E突變特點。方法 收集316例廣東梅州客家地區(qū)的甲狀腺癌患者的臨床資料及BRAF基因V600E突變檢測結果，對BRAF基因V600E突變與腫瘤特征的關系進行單因素分析和多因素Logistic回歸分析。結果 316例患者BRAF基因V600E總體突變率為75.3% （238/316），其中乳頭狀癌突變率為77.0%（238/309）。單因素分析顯示BRAF基因V600E突變型患者腫瘤徑線較小，縱橫比大于1、微鈣化比例較高，Ⅵ區(qū)和頸側區(qū)淋巴結轉移比例較低（P均< 0.05）;多因素Logistic回歸分析提示BRAF V600E突變與Ⅵ區(qū)淋巴結轉移（OR = 2.289， 95% CI = 1.283 ～ 4.081， P = 0.005）、超聲回聲（OR = 0.419， 95% CI = 0.209 ～ 0.841， P = 0.014）及粗大鈣化（OR = 3.673， 95% CI = 1.395 ～ 9.668， P = 0.008）有關。結論 廣東梅州客家地區(qū)人群甲狀腺癌BRAF基因V600E突變率較高，BRAF基因V600E突變者易發(fā)生Ⅵ區(qū)淋巴結轉移。

【關鍵詞】BRAF V600E;基因突變;甲狀腺癌;客家

Mutation characteristics of BRAF V600E in thyroid carcinoma patients from Meizhou Hakka area： a single center study of 316 cases Zeng Qingxin， Rao Hui， Wang Yuedong， Lai Yeqian， Zhong Haifeng. Department of Thyroid Surgery， Meizhou Peoples Hospital//Meizhou Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University， Meizhou 514031， China

Corresponding author， Zeng Qingxin， E-mail： zengqingxin87@ 126. com

【Abstract】Objective To summarize the mutation characteristics of V-raf munine sarcom viral oncogene homolog （BRAF） V600E in Meizhou Hakka patients with thyroid carcinoma. Methods Clinical data and BRAF V600E detection results of 316 thyroid carcinoma patients from Meizhou Hakka area were collected. The relationship between BRAF V600E mutation and tumor characteristics was analyzed by univariate and multivariate logistic regression analyses. Results The overall BRAF V600E mutation rate was 75.3% （238/316） of thyroid carcinoma patients from Meizhou Hakka area， and 77.0% （238/309） for the mutation rate of papillary thyroid carcinoma. Univariate analysis suggested that patients with BRAF V600E mutation showed smaller tumor diameter， higher proportion of aspect ratio of > 1 and microcalcification， less proportion of lymph node metastasis in the VI and lateral cervical regions （all P < 0.05）. Multivariate logistic regression analysis indicated that BRAF V600E mutation was significantly associated with lymph node metastasis in the VI region （OR = 2.289， 95%CI = 1.283-4.081， P = 0.005）， ultrasonic echo （OR = 0.419， 95%CI = 0.209-0.841， P = 0.014） and gross calcification （OR = 3.673， 95%CI = 1.395-9.668， P = 0.008）. Conclusion The BRAF V600E mutation rate of thyroid carcinoma patients from Meizhou Hakka area is relatively high. BRAF V600E mutation is prone to lymph node metastasis in the VI region.

【Key words】V-raf munine sarcom viral oncogene homolog V600E;Gene mutation;

Thyroid carcinoma;Hakka

甲狀腺癌是目前發(fā)病率最高的內分泌腫瘤，其中乳頭狀癌最常見，約占甲狀腺癌的80% ～ 90%[1-2]。大部分甲狀腺癌惡性程度低，預后好，但也有小部分預后不佳，早期可出現(xiàn)淋巴結轉移。年齡、病理類型、腫瘤大小、腫瘤分期、基因突變促使腫瘤細胞增殖侵襲等是影響甲狀腺癌預后的重要因素[3-4]。

近年來有研究表明鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（BRAF）基因突變與甲狀腺癌的診斷及預后相關[5]。BRAF基因位于人染色體7q34，含有18個外顯子，最常見的突變類型是1799位的胸苷酸被腺苷酸替代（T1799A），導致翻譯蛋白質的第600位密碼子由纈氨酸轉變成谷氨酸（V600E）[6]。該突變使絲裂原活化蛋白激酶通路活化，導致細胞異常增殖[7]。BRAF 基因在不同病理類型的甲狀腺癌中的V600E突變率不同，文獻報道在29% ～ 94%不等[3， 8-9]。BRAF基因V600E突變與腫瘤的高侵襲性、高復發(fā)性有關，影響腫瘤細胞的包膜外浸潤、淋巴結轉移、腫瘤多灶性、治療有效性[10-12]。

BRAF基因V600E突變率可能與地域、血統(tǒng)、種族有關。盡管不少研究者分析了BRAF 基因V600E突變與甲狀腺癌臨床病理特征的關系，但迄今為止未見BRAF 基因V600E突變在客家人群中的報道。中原漢族南遷形成了客家民系，梅州是客家人南遷的最后落腳點，被譽為“世界客都”，是典型的客家代表。本研究組以梅州當?shù)氐目图胰藶檠芯繉ο?，通過搜集客家人中的甲狀腺癌患者的臨床資料，了解BRAF基因V600E突變在客家人群中的分布，探究該突變與甲狀腺癌臨床病理特征的關系，以明確BRAF基因V600E突變對客家人群甲狀腺癌的診斷和預后的意義。

對象與方法

一、研究對象

收集2017年7月至2020年9月在梅州市人民醫(yī)院診治并在術后行BRAF基因V600E檢測的甲狀腺癌患者的病歷資料，按納入及排除標準共篩選出316例患者，其中男48例、女268例，年齡（43.07±13.06）歲。收集316例患者的臨床資料包括：性別、年齡、腫瘤病理類型、術前促甲狀腺激素水平、術前甲狀腺球蛋白水平、癌灶個數(shù)、腫瘤最大徑、甲狀腺合并疾病、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、彩色多普勒超聲檢查（彩超）的超聲回聲以及腫瘤包膜完整情況、縱橫比、鈣化等資料。本研究方案經梅州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（梅市倫審2020-C-101）。

二、納入及排除標準

納入標準：①祖上三代籍貫均為廣東梅州并于本土成長和生活的患者;②首次手術治療的甲狀腺癌患者;③術前甲狀腺彩超、甲狀腺功能、甲狀腺球蛋白等臨床檢查資料齊全;④術后有行常規(guī)組織病理學檢查確認甲狀腺癌的大小、數(shù)目、腫瘤與被膜關系、淋巴結轉移等情況;⑤有應用實時熒光定量PCR法檢查術后病理組織明確BRAF基因是否存在V600E突變。排除標準： ①同時合并其他惡性腫瘤或其他有可能引起B(yǎng)RAF基因V600E突變的疾病患者;②復發(fā)性甲狀腺癌多次手術或多次接受放射性碘治療后的患者;③合并嚴重的心、肺、肝、腎疾病患者。

三、BRAF基因V600突變檢測

取術后切除的甲狀腺腫瘤石蠟包埋切片，消化、去除組蛋白、去除RNA，DNA以核酸提取柱提取，采用實時熒光定量PCR法檢測BRAF基因V600E突變情況。使用AmoyDx（FFPE DNA）核酸提取試劑盒、人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司）、PCR儀（實時熒光定量PCR儀SLAN-96S，上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。待測樣品的內控HEX（或VIC）信號應有明顯擴增曲線，且Ct值應在13 ～ 21之間。若FAM信號有明顯的擴增曲線，且Ct值 < 28，該樣本無需重復檢測，檢測結果為BRAF基因V600E突變陽性;若Ct值 ≥ 28，檢驗結果為BRAF 基因V600E突變陰性。根據(jù)BRAF基因V600E突變與否將患者分為突變型組和野生型組。

四、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的2組計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的2組計量資料用中位數(shù)（上四分位數(shù)，下四分位數(shù)）[M（P25， P75）]表示，比較采用Wilcoxon秩和檢驗;2組計數(shù)資料用例（%）表示，比較采用χ2檢驗。以基因型為因變量，以2組比較中P < 0.15的因素為自變量，進行二分類Logistic回歸分析，變量進入方程的方法為向前-逐步。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、各種病理類型甲狀腺癌患者的BRAF基因V600E突變情況

316例中突變型組238例，診斷均為乳頭狀癌;野生型組78例，其中乳頭狀癌 71例、具有乳頭樣核特征的非浸潤性甲狀腺濾泡性腫瘤（NIFTP） 3例、濾泡狀癌2例、低分化癌1例、未分化癌1例。本研究中，BRAF基因V600E總體突變率是75.3%（238/316），乳頭狀癌的突變率為77%（238/309）。

二、乳頭狀癌中BRAF基因V600E突變與臨床特征的相關性

對突變型組和野生型組中乳頭狀癌患者的臨床資料進行比較，腫瘤最大徑、縱橫比、鈣化、Ⅵ區(qū)淋巴結轉移、頸側區(qū)淋巴結轉移比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05），見表1。

三、乳頭狀癌中BRAF基因V600E突變與甲狀腺伴隨疾病的相關性

對乳頭狀癌是否合并結節(jié)性甲狀腺腫或橋本甲狀腺炎的BARF基因V600E突變情況進行比較，在合并結節(jié)性甲狀腺腫者和無合并者中BRAF基因V600E突變率相當（P > 0.05）;合并橋本甲狀腺炎者的突變率較無合并者高（84.6% vs. 75.0%），但比較差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.067），見表2。

四、乳頭狀癌中BRAF基因V600E突變與臨床特征及伴隨疾病多因素Logistic回歸分析

將單因素分析中P < 0.05或有專業(yè)意義的因素（包括腫瘤直徑分組、縱橫比、鈣化、包膜侵犯、彩超回聲、Ⅵ區(qū)淋巴結轉移、頸側區(qū)淋巴結轉移、遠處轉移、橋本甲狀腺炎）納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示方程中的變量為鈣化、超聲回聲和Ⅵ區(qū)淋巴結轉移，相應的OR值和95% CI如表3所示。

討論

梅州是全球最具代表性的客家人聚居地，梅州客家民系來源于中原血統(tǒng)，經過歷史的遷徙，形成了不同于中國南方漢人的方言與習俗，具有獨特的遺傳背景。本研究以梅州客家人群為研究對象，分析其甲狀腺癌BRAF基因V600E突變的特點，對了解BRAF基因V600E突變在客家人群甲狀腺癌中的分布，以及協(xié)助甲狀腺癌的診治和評估預后具有重要的臨床意義。

既往文獻報道了不同國家、人種甲狀腺癌患者BRAF基因V600E突變情況。在澳大利亞城市人群中，68%的甲狀腺乳頭狀癌患者存在BRAF基因V600E突變[13]。希臘的甲狀腺乳頭狀癌患者BRAF基因V600E突變率為17%[14]。中國西北地區(qū)的BRAF基因V600E突變率為86.7%[8]。亞洲國家的突變率較西方高，中國甲狀腺乳頭狀癌患者BRAF基因V600F突變率為72.4%，高于美國的59.7%[9]。本研究結果顯示，納入的梅州客家甲狀腺癌患者的BRAF基因V600E突變率為75.3%，其中乳頭狀癌突變率為77.0%，呈現(xiàn)出較高的突變率，與文獻報道的亞裔人群突變率相似[15]。

在本研究中，突變型組和野生型組的年齡相當，≥55歲的比例較野生型組稍高，但差異無統(tǒng)計學意義，提示年齡不是BRAF基因V600E突變的影響因素。一項包含25 241例甲狀腺乳頭狀癌患者的Meta分析表明BRAF基因V600E突變與年齡無關[16]。王晶等[17]的研究也提示年齡不影響B(tài)RAF基因V600E突變的發(fā)生。Shen等[18]的多中心研究顯示對于存在BRAF基因V600E突變的甲狀腺乳頭狀癌患者，隨著年齡的增長，病死率增加。因此，盡管我們的研究結果顯示年齡與BRAF基因V600E突變無關，但仍不能忽視年齡的因素，年齡的意義更多在于評估BRAF基因V600E突變患者的預后，而并非預測是否發(fā)生BRAF基因V600E突變。

在腫瘤最大徑及Ⅵ區(qū)淋巴結、頸側區(qū)淋巴結轉移方面，單因素分析顯示野生型組表現(xiàn)出更大的腫瘤最大直徑及更高比例的淋巴結轉移，多因素Logistic回歸控制混雜因素后，BRAF基因V600E突變只影響Ⅵ區(qū)淋巴結轉移，突變型發(fā)生Ⅵ區(qū)淋巴結轉移的概率是野生型的2.289倍，符合惡性腫瘤的一般規(guī)律。多數(shù)研究者認為BRAF基因V600E突變具有更高的惡性程度，在腫瘤生長速度及淋巴結轉移等方面高于野生型[3， 7-8， 19]。但也有少數(shù)研究者提出相反意見，認為突變型發(fā)生頸側區(qū)淋巴結轉移的風險更低[20]。由我們的結果可以推斷，和大多數(shù)人群一樣，梅州客家人群甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因V600E突變型者腫瘤侵襲性更強。

對于縱橫比 > 1、微鈣化等超聲表現(xiàn)，突變型組的比例高于野生型組，但多因素Logistic回歸分析提示BRAF基因V600E突變更傾向于表現(xiàn)為粗大鈣化和等回聲，而與縱橫比無關。當前研究者們普遍認為微鈣化、低回聲等超聲表現(xiàn)是判斷甲狀腺結節(jié)為惡性的重要依據(jù)[21]。但本研究結果與此相反，或因客家人群的腫瘤特征有別于傳統(tǒng)漢人，未表現(xiàn)出典型的惡性征象，也有可能是樣本量小所致，需要進一步研究。

在相關伴隨癥狀中，結節(jié)性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎與BRAF基因V600E突變無關，這與先前關于藏族人群BRAF基因V600E突變的研究相似[22]。也有研究者認為橋本甲狀腺炎對甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展有重要影響，其可下調BRAF基因V600E突變率，降低頸中央區(qū)淋巴結的轉移率，降低腫瘤的侵襲性[23]。目前關于甲狀腺癌伴隨疾病與BRAF基因V600E突變的關系尚無統(tǒng)一定論。

綜上所述，梅州地區(qū)客家人群甲狀腺癌BRAF基因V600E突變率較高，突變型更易發(fā)生Ⅵ區(qū)淋巴結轉移，BRAF基因V600E突變檢測可協(xié)助評估梅州客家人群甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移情況，評估預后。

參 考 文 獻

[1] Kim SY， Kim T， Kim K， Bae JS， Kim JS， Jung CK. Highly prevalent BRAF V600E and low-frequency TERT promoter mutations underlie papillary thyroid carcinoma in Koreans. J Pathol Transl Med， 2020，54（4）：310-317.

[2] Liu J， Liu R， Shen X， Zhu G， Li B， Xing M. The genetic duet of BRAF V600E and TERT promoter mutations robustly predicts loss of radioiodine avidity in recurrent papillary thyroid cancer. J Nucl Med， 2020，61（2）：177-182.

[3] Estrada-Flórez AP， Bohórquez ME， Vélez A， Duque CS， Donado JH， Mateus G， Panqueba-Tarazona C， Polanco-Echeverry G， Sahasrabudhe R， Echeverry M， Carvajal-Carmona LG. BRAF and TERT mutations in papillary thyroid cancer patients of Latino ancestry. Endocr Connect， 2019，8（9）：1310-1317.

[4] Chang CC， Chang YS， Huang HY， Yeh KT， Liu TC， Chang JG. Determination of the mutational landscape in taiwanese patients with papillary thyroid cancer by whole-exome sequencing. Hum Pathol，2018，78：151-158.

[5] Hussain MR， Baig M， Mohamoud HS， Ulhaq Z， Hoessli DC， Khogeer GS， Al-Sayed RR， Al-Aama JY. BRAF gene： from human cancers to developmental syndromes. Saudi J Biol Sci， 2015，22（4）：359-373.

[6] 李響， 馬芙蓉. 甲狀腺癌相關基因及靶向治療研究進展. 新醫(yī)學， 2020，51（12）：902-906.

[7] Trybek T， Walczyk A， G?sior-Perczak D， Pa?yga I， Mikina E， Kowalik A， Hińcza K， Kopczyński J， Chrapek M， Gó?d? S，

Kowalska A. Impact of BRAF V600E and TERT promoter mutations on response to therapy in papillary thyroid cancer. Endocrinology， 2019，160（10）：2328-2338.

[8] Huang M， Yan C， Xiao J， Wang T， Ling R. Relevance and clinicopathologic relationship of BRAF V600E， TERT and NRAS mutations for papillary thyroid carcinoma patients in Northwest China. Diagn Pathol， 2019，14（1）：74-83.

[9] Liang J， Cai W， Feng D， Teng H， Mao F， Jiang Y， Hu S， Li X， Zhang Y， Liu B， Sun ZS. Genetic landscape of papillary thyroid carcinoma in the Chinese population. J Pathol， 2018，244（2）：215-226.

[10] Decaussin-Petrucci M， Descotes F， Depaepe L， Lapras V， Denier ML， Borson-Chazot F， Lifante JC， Lopez J. Molecular testing of BRAF， RAS and TERT on thyroid FNAs with indeterminate cytology improves diagnostic accuracy. Cytopathology， 2017，28（6）：482-487.

[11] Chen B， Shi Y， Xu Y， Zhang J. The predictive value of coexisting BRAFV600E and TERT promoter mutations on poor outcomes and high tumour aggressiveness in papillary thyroid carcinoma： a systematic review and meta-analysis. Clin Endocrinol （Oxf），2021，94（5）：731-742.

[12] Bae JS， Kim Y， Jeon S， Kim SH， Kim TJ， Lee S， Kim MH， Lim DJ， Lee YS， Jung CK. Clinical utility of TERT promoter mutations and ALK rearrangement in thyroid cancer patients with a high prevalence of the BRAF V600E mutation. Diagn Pathol， 2016，11：21.

[13] Mond M， Alexiadis M， Fuller PJ， Gilfillan C. Mutation profile of differentiated thyroid tumours in an Australian urban population. Intern Med J， 2014，44（8）：727-734.

[14] Argyropoulou M， Veskoukis AS， Karanatsiou PM， Manolakelli A， Kostoglou-Athanassiou I， Vilaras G， Karameris A， Liadaki K. Low prevalence of TERT promoter， BRAF and RAS mutations in papillary thyroid cancer in the Greek population. Pathol Oncol Res， 2020，26（1）：347-354.

[15] Bychkov A. Prevalence of BRAF（V600E） mutation in Asian patients with thyroid cancer. Malays J Pathol， 2017，39（1）：95-96.

[16] Zhang Q， Liu SZ， Zhang Q， Guan YX， Chen QJ， Zhu QY. Meta-analyses of association between BRAF（V600E） mutation and clinicopathological features of papillary thyroid carcinoma. Cell Physiol Biochem， 2016，38（2）：763-776.

[17] 王晶， 劉龍騰， 崔娣， 何磊， 劉冬戈. BRAF V600E突變與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生及預后相關因素分析. 中華病理學雜志， 2019，48（4）：288-292.

[18] Shen X， Zhu G， Liu R， Viola D， Elisei R， Puxeddu E， Fugazzola L， Colombo C， Jarzab B， Czarniecka A， Lam AK， Mian C， Vianello F， Yip L， Riesco-Eizaguirre G， Santisteban P， ONeill CJ， Sywak MS， Clifton-Bligh R， Bendlova B， S?korová V， Xing M. Patient age-associated mortality risk is differentiated by BRAF V600E status in papillary thyroid cancer. J Clin Oncol， 2018，36（5）：438-445.

[19] 王成晨， 向大鵬， 李志宇. 甲狀腺乳頭狀癌相關基因突變與其臨床病理特征的關系. 實用腫瘤雜志， 2019，34（3）：239-244.

[20] Yan C， Huang M， Li X， Wang T， Ling R. Relationship between BRAF V600E and clinical features in papillary thyroid carcinoma. Endocr Connect， 2019，8（7）：988-996.

[21] 中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會. 甲狀腺癌診療規(guī)范（2018年版）. 中華普通外科學文獻 （電子版）， 2019，13（1）：1-15.

[22] 何丹， 朱坪， 劉林， 江成浩， 劉譽澤， 陳禎勇. 藏族人群甲狀腺微小乳頭狀癌BRAFV600E基因突變及臨床意義. 腫瘤預防與治療， 2019，32（3）：233-237.

[23] 陳妮， 黃曉玲， 劉麗萍， 李茂萍， 彭曉瓊. 甲狀腺乳頭狀癌伴橋本甲狀腺炎的超聲表現(xiàn)及其與侵襲性和BRAFV600E突變的關系. 臨床超聲醫(yī)學雜志， 2020，22（7）：515-518.

（收稿日期：2021-01-25）

（本文編輯：洪悅民）