miR-17-5p靶向PI3K/AKT信號通路調控皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的機制

郭金蘭 甘才斌 張潔 董明亮 馬新蘋

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院皮膚科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

皮膚鱗狀細胞癌是一種起源于皮膚或其附屬物的惡性腫瘤，已嚴重威脅人類的健康〔1〕。目前，臨床主要采用手術、放療、化療和聯(lián)合治療等治療方法，但由于這些治療方法的局限性，并未產生理想的治療效果〔2〕。因此，尋找具有更好療效的新治療方法顯得至關重要。miR-17-5p是miR-17-92基因簇的重要成員，研究〔3，4〕表明，miR-17-5p的異常表達與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲轉移密切相關。例如，miR-17-5p在口腔鱗狀細胞癌中表達明顯上調，miR-17-5p可通過抑制其下游靶基因SOCS6促進腫瘤細胞的增殖〔3〕；但miR-17-5p在三陰性乳腺癌中表達顯著下調，過表達miR-17-5p可通過靶向下調ETV1抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖和侵襲〔4〕。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路與癌癥的相關性研究是近年來的研究熱點。已有研究〔5～7〕表明，miRNA通過調控PI3K/AKT信號通路與膠質瘤、宮頸癌和甲狀腺乳頭狀癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。例如，miR-489通過靶向spin1介導的PI3K/AKT通路抑制膠質瘤細胞增殖，誘導膠質瘤細胞凋亡〔5〕；miR-383通過下調PARP2抑制PI3K-AKT-MTOR信號通路抑制宮頸癌的發(fā)生〔6〕；miRNA-148a通過STAT3和PI3K/AKT信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞生長〔7〕。但尚無miR-17-5p在皮膚鱗狀細胞癌的相關研究，且miR-17-5p能否通過介導PI3K/AKT信號通路參與調控皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡也尚未可知。因此，本研究探討miR-17-5p靶向PI3K/AKT信號通路對皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料與主要試劑、儀器 皮膚鱗狀細胞癌A431細胞和人永生化角質形成細胞HaCaT購自美國ATCC。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自賽默飛公司；LipofectamineTM2000轉染試劑和TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；Inhibitor-con、miR-17-5p inhibitor、WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1的構建和測序由上海生工公司提供；RIPA試劑、噻唑藍(MTT)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western印跡相關試劑均購自北京索萊寶公司。兔抗PIK3R1、p-AKT、p-PI3K、cyclinD1、Bcl-2和Bax抗體購于美國Abcam公司，兔抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于武漢博士德公司。胰島素樣生長因子(IGF)-1和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；酶標儀購自美國Thermo公司；實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈式反應(PCR)儀購自美國ABI公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2細胞培養(yǎng)與轉染 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A431和HaCaT細胞。定期觀察細胞生長情況，當細胞融合度達到80%時，用胰酶消化進行傳代。取對數生長期的A431細胞，以細胞密度為2×105個/孔接種于6孔板，當細胞融合度約為60%時，用LipofectamineTM2000將NC、Inhibitor-con和miR-17-5p inhibitor分別轉染A431細胞。于細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h后，進行后續(xù)實驗分析。實驗分組如下：NC組，Inhibitor-con組、miR-17-5p inhibitor(轉染miR-17-5p inhibitor)組。為了進一步驗證miR-17-5p是通過抑制PI3K/AKT信號通路來調控皮膚鱗狀細胞癌細胞A431的增殖和凋亡，當A431細胞轉染miR-17-5p inhibitor 48 h后，用100 ng/ml的IGF-1〔8〕處理1 h，隨后進行后續(xù)實驗分析。實驗分為miR-17-5p inhibitor組(轉染miR-17-5p inhibitor)和miR-17-5p inhibitor+IGF-1組(轉染miR-17-5p inhibitor后，用IGF-1處理)。

1.3qRT-PCR檢測 利用TRIzol試劑從HaCaT細胞及各組A431細胞中提取總RNA，將其逆轉錄為cDNA，隨后以cDNA為模板，進行qRT-PCR擴增。所有引物由北京華大基因提供。以U6作為miR-17-5p的內參，用2-ΔΔCt方法計算miR-17-5p的相對表達量。引物序列如下：miR-17-5p上游引物：5′-CTCTTACAGTGCAGGTAGAAAA-3′，下游引物：5′-GAGC-AGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物：5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。

1.4MTT法檢測細胞增殖活力 將對數期A431細胞以每孔1×105個細胞數接種于96孔板，按照上述細胞轉染方法向A431細胞轉染miR-17-5p inhibitor或Inhibitor-con后，分別于轉染后0 h、24 h、48 h、72 h時間點向每孔中加入MTT試劑20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內上清，向每孔中加入150 μl的DMSO，振蕩10 min至完全溶解，用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值(用空白孔進行調零)。為了證明IGF-1可以逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞增殖的影響，分別在轉染0 h、24 h、48 h、72 h后，用100 ng/ml的IGF-1處理1 h，然后按照上述步驟檢測細胞活力。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組A431細胞，用胰酶消化后離心，棄上清液，收集各組細胞，用預冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞2次，加入適量的1×結合緩沖液輕輕吹打重懸細胞，然后加入5 μl的Annexin V-FITC進行混勻，在室溫條件下避光孵育15 min后，加入5 μl的PI染色，隨后用流式細胞儀測定各組A431細胞的凋亡情況。

1.6Western印跡檢測 用RIPA細胞裂解液裂解各組A431細胞，提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，分別取30 μg各組細胞蛋白，煮沸5 min充分變性后，用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，當電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜，用10%的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入Western印跡洗滌液充分洗滌(3次×10 min/次)，分別加入稀釋好的抗PIK3R1、β-actin、p-AKT、p-PI3K、細胞周期素(Cyclin)D1、Bax和Bcl-2蛋白的一抗4℃孵育過夜后，Western印跡洗滌液充分漂洗(3次×10 min/次)，加入HRP標記的二抗室溫孵育膜1 h，Western印跡洗滌液充分漂洗(3次×10 min/次)后，用ECL試劑盒進行顯色，利用灰度分析軟件Image J對目的條帶進行分析(以β-actin為內參)。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預測數據庫Target Scan (http：//www.targetscan.org)預測miR-17-5p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-17-5p的5′端可與PIK3R1的3′-UTR特異性結合，猜測PIK3R1是miR-17-5p的靶基因。為驗證這一猜想，構建野生型WT-PIK3R1和突變型MUT-PIK3R1的PIK3R1 3′-UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM2000將miR-17-5p和miR-con分別與WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1共轉染A431細胞，然后將各組A431細胞于細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟對各組A431細胞的熒光素酶活性進行檢測。

1.8統(tǒng)計學方法 利用SPSS19.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-17-5p在人永生化角質形成細胞HaCaT和皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中的表達 與HaCaT細胞中miR-17-5p表達量(0.81±0.12)比較，皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中(3.45±0.41)表達顯著上調(t=10.704，P=0.000)。表明miR-17-5p在皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中呈高表達，在人永生化角質形成細胞HaCaT中呈低表達。

2.2抑制miR-17-5p表達對A431細胞增殖的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞中miR-17-5p的表達顯著降低(P<0.001)。表明成功構建了抑制miR-17-5p表達的A431細胞株。與NC組和Inhibitor-con組相比，miR-17-5p inhibitor組A431細胞在0 h、24 h時間點細胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時A431細胞增殖活力顯著降低，CyclinD1蛋白的表達顯著降低(均P<0.01)，見表1和圖1。提示抑制miR-17-5p表達可抑制A431細胞的增殖。

表1 抑制miR-17-5p表達對A431細胞增殖的影響

1～3：NC組,Inhibitor-con組,miR-17-5p inhibitor組，圖2、4同圖1 Western印跡檢測抑制miR-17-5p表達后A431細胞CyclinD1的表達

2.3抑制miR-17-5p表達對A431細胞凋亡的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞的凋亡率顯著增加，促凋亡蛋白Bax的表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低(均P<0.001)。見圖2、表2。表明抑制miR-17-5p表達可促進A431細胞凋亡。

圖2 Western印跡檢測抑制miR-17-5p表達對A431細胞凋亡的影響

表2 抑制miR-17-5p表達對A431細胞凋亡的影響

2.4miR-17-5p靶向調控PIK3R1的表達 圖3A結果顯示，miR-17-5p與WT-PIK3R1的3′UTR之間存在特異性結合位點。野生型PIK3R1基因熒光素酶表達載體WT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共轉染A431細胞后，miR-17-5p組A431細胞熒光素酶活性較miR-con組明顯降低(P<0.01)；而突變型PIK3R1基因熒光素酶表達載體MUT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共轉染A431細胞后，miR-17-5p組A431細胞熒光素酶活性較miR-con組差異不顯著(P>0.05)。見圖3B、表3。與mimic-con組A431細胞PIK3R1蛋白的表達量(0.76±0.14)比較，miR-17-5p mimic組(0.32±0.05)顯著減低；與inhibitor-con組A431細胞PIK3R1蛋白表達量(0.71±0.11)比較，miR-17-5p inhibitor組(1.32±0.19)顯著升高(P<0.05)。提示PIK3R1是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p可負性調控PIK3R1的表達。

1～4:mimic-con組，miR-17-5p mimic組，inhibitor-con組，miR-17-5p inhibitor組;A：通過TargetScan對miR-17-5p和結合進行預測示意圖；B：Western印跡檢測PIK3R1蛋白表達圖3 miR-17-5p靶向調控PIK3R1的表達

表3 miR-con或miR-17-5p與報告質粒共轉染A431細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5抑制miR-17-5p表達對PI3K/AKT信號通路下游蛋白表達的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞中p-AKT和p-PI3K蛋白的表達顯著降低(均P<0.001)。見圖4，表4。表明抑制miR-17-5p表達可抑制A431細胞中PI3K/AKT信號通路下游蛋白的表達。

圖4 Western印跡檢測p-AKT和p-PI3K蛋白的表達

表4 Western印跡檢測p-AKT和p-PI3K的蛋白表達

2.6PI3K/AKT信號通路激活劑IGF-1可以逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞的增殖抑制和凋亡促進作用 與Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞在0 h、24 h時間點細胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時A431細胞增殖活力顯著降低，A431細胞凋亡率顯著升高，p-AKT和p-PI3K蛋白的表達顯著降低(均P<0.05)；與miR-17-5p inhibitor組比較，miR-17-5p inhibitor+IGF-1組A431細胞在0 h、24 h時間點細胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時A431細胞增殖活力顯著升高，A431細胞凋亡率顯著降低，p-AKT和p-PI3K蛋白的表達顯著升高(均P<0.05)。見圖5，表5，表6。以上結果表明，PI3K/AKT信號通路激活劑IGF-1可逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。

1～3:Inhibitor-con組、miR-17-5p inhibitor組、miR-17-5p inhibitor+IGF-1組圖5 Western印跡檢測p-AKT、 p-PI3K蛋白表達

表5 IGF-1處理轉染miR-17-5p inhibitor的A431細胞增殖和凋亡情況

表6 Western印跡檢測p-AKT、 p-PI3K蛋白表達

3 討 論

miR-17-5p屬于miR-17家族，編碼基因位于人類13q31和嚙齒類14qE4染色體上，已有研究〔9～11〕發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在宮頸癌中高表達，通過靶向轉化生長因子β受體(TGFBR)2促進宮頸癌的增殖和轉移；miR-17-5p還可通過靶向p21促進鼻咽癌細胞增殖和腫瘤發(fā)生。然而，在前列腺癌中，miR-17-5p表達下調，過表達miR-17-5p可抑制癌細胞的生長和雄激素受體的轉錄活性。PI3K/AKT信號通路是惡性腫瘤中最活躍的信號通路之一，PI3K由一個催化亞基和一個調節(jié)亞基構成，PIK3R1基因編碼的p85α是主要的調節(jié)亞基，p85α通過與催化亞基p110結合，抑制p110的催化活性，抑制PI3K/AKT通路的活化。PI3K/AKT信號通路相關基因的異常表達是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的常見驅動因素。研究〔12～14〕發(fā)現(xiàn)，多種miRNA通過調控PI3K/AKT信號通路相關基因的表達影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。如miR-106b和miR-93通過PI3K/AKT通路抑制PTEN來調控乳腺癌的進展〔12〕；miR-451通過下調PI3K/AKT通路抑制人結腸癌細胞生長〔13〕；miR-497通過靶向胰島素樣生長因子1受體(IGFR)1可抑制結腸癌細胞的存活、增殖和侵襲〔14〕。但miR-17-5p和PI3K/AKT信號通路在皮膚鱗狀細胞癌中作用尚不清楚。

PIK3R1的異常表達，可減少p85α對p110的抑制作用，甚至干擾p85α對其他基因的調控，導致PI3K/AKT信號通路的意外活化，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔15～17〕。本研究結果表明抑制miR-17-5p表達可能通過上調PIK3R1，增強p85α對p110的抑制作用，抑制PI3K/AKT信號通路的活化，進而抑制PI3K/AKT信號通路下游蛋白p-AKT和p-PI3K的表達，從而抑制A431細胞的增殖，促進其凋亡，IGF-1可逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。王延東〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-455-3p.1也可通過靶向下調PIK3R1基因表達，促進p-AKT蛋白表達，促進腎透明細胞癌細胞增殖、侵襲與轉移。提示miR-17-5p可能通過下調PIK3R1基因，激活PI3K/AKT信號通路，促進p-AKT和p-PI3K蛋白的表達，參與皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展。