下調(diào)miR-372靶向調(diào)控BTG1表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子的影響

蘇保壽 薛治乾 余鵬飛 吳益敏 喻聞慶

(儋州市人民醫(yī)院 1神經(jīng)外科，海南 儋州 571799；2病理科)

膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)〔1〕。研究表明，免疫逃逸是腫瘤惡性進(jìn)展的重要原因，腫瘤細(xì)胞分泌合成的免疫抑制因子如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素(IL)-8是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的基礎(chǔ)〔2〕。miRNA具有功能多樣的特點(diǎn)，分別在不同的組織及生理進(jìn)程中發(fā)揮作用，與多種細(xì)胞的生長、運(yùn)動、能量代謝等有關(guān)〔3〕。研究顯示，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其不僅參與腫瘤細(xì)胞的惡性表型的轉(zhuǎn)變過程，還與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)，研究miRNA在腫瘤中的作用對于腫瘤的治療和闡明腫瘤分子發(fā)生機(jī)制具有重要意義〔4〕。miR-372參與腫瘤進(jìn)程，在肺鱗癌、肝癌中的研究報(bào)道顯示，miR-372作為一種腫瘤促進(jìn)因子誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖，而在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)miR-372作為一種抑癌基因發(fā)揮抗腫瘤作用〔5～7〕。在膠質(zhì)瘤中的研究表明，miR-372表達(dá)上調(diào)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良有關(guān)，并且下調(diào)miR-372可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，miR-372在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中發(fā)揮類似癌基因的作用〔8,9〕。目前對于miR-372在膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子中的作用還不明確。本實(shí)驗(yàn)探討下調(diào)miR-372對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251分泌免疫抑制因子TGF-β1、VEGF、IL-8的影響和靶向調(diào)控機(jī)制，為研究miR-372在腫瘤免疫逃逸中的作用提供參考，為靶向基因治療膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、SHG-44和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA購自美國ATCC；IL-8含量檢測試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰荆籹iRNA對照(control)、B細(xì)胞易位基因(BTG)1 siRNA由廣州易錦生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；VEGF含量檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；抑制劑(inhibitor)control、miR-372 inhibitor、模擬物(mimics)control、miR-372 mimics由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；TGF-β1含量檢測試劑盒購自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；BTG1抗體購自美國Proteintech；野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2miR-372在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)差異檢測 收集膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、SHG-44和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA，用Realtime PCR方法測定miR-372水平。以Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，按照如下體系合成cDNA，包括：1 μl的RNA、8 μl的RNase-free Water、2 μl的5×PrimersScript RT Master Mix，cDNA合成條件為：37℃孵育15 min，85℃孵育5 s；按照如下體系進(jìn)行Realtime PCR，包括：5 μl的2×SYBR緩沖液、上下游引物各0.5 μl、1 μl的cDNA，添加雙氧水(ddH2O)至25 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃孵育4 min；94℃孵育30 s；60℃孵育15 s；72℃孵育30 s，一共30個循環(huán)。內(nèi)參U6引物：正義鏈-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；反義鏈-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；miR-372引物：正義鏈-CAACAGAAGGCTCGAGCAACCTGCGGAGAAGATAC；反義鏈-TTCTGATCAGGATCCCATTACAGCCAGACGCTGTAAG。用2-△△Ct法分析miR-372水平。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和下調(diào)效果檢測 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251分成Control組、Anti-NC組、Anti-miR-372組，Anti-NC組、Anti-miR-372組分別為使用Lipofectami-ne2000轉(zhuǎn)染inhibitor control、miR-372 inhibitor的細(xì)胞，Control組為沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟完全按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，按照1.2中Realtime PCR方法測定下調(diào)效果。

1.4下調(diào)miR-372對膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的影響檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測TGF-β1、VEGF、IL-8水平。收集培養(yǎng)48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-372組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，分別使用TGF-β1、VEGF、IL-8含量測定試劑盒檢測上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平，步驟完全按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.5miR-372靶基因預(yù)測和鑒定 生物信息學(xué)軟件targetscan預(yù)測miR-372的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BTG1的3'UTR端與miR-372有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，使用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系。將WT和MUT熒光素酶報(bào)告載體分別同mimics control、miR-372 mimics共轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，培養(yǎng)48 h以后，用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。WT熒光素酶報(bào)告載體含有BTG1的3′UTR端結(jié)合位點(diǎn)，MUT熒光素酶報(bào)告載體含有突變以后的BTG1的3′UTR端結(jié)合位點(diǎn)。

1.6下調(diào)miR-372對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中BTG1蛋白表達(dá)影響檢測 收集培養(yǎng)48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-372組細(xì)胞，分別添加0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，然后在每個孔中添加200 μl的裂解溶液，用細(xì)胞刮刀收集裂解液，放在冰上裂解30 min。收集上清(蛋白上清)，添加到上樣緩沖液中混合，100℃煮沸5 min。上樣(每孔上樣30 μg)，在上層膠中使用90 V電泳，在下層膠中使用120 V電泳。以300 mA電流轉(zhuǎn)膜1 h。將硝酸纖維素(NC)膜放在封閉液中孵育1.5 h。把NC膜放在一抗反應(yīng)液中，在4℃過夜。NC膜放在HRP標(biāo)記的二抗稀釋液中，置于室溫中孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。用Image J分析條帶的灰度值，GAPDH作為內(nèi)參，分析BTG1蛋白水平。BTG1一抗稀釋倍數(shù)為1∶1 000，二抗稀釋倍數(shù)為1∶2 000，抗體均用封閉液稀釋，封閉液為5%牛血清白蛋白的TBST。

1.7BTG1 siRNA對下調(diào)miR-372影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的作用檢測 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中BTG1分別共轉(zhuǎn)染miR-372 inhibitor、siRNA control和miR-372 inhibitor、BTG1 siRNA，記為Anti-miR-372+si-NC組、Anti-miR-372+si-BTG1組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，ELISA方法測定培養(yǎng)液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平，Western印跡檢測細(xì)胞中BTG1蛋白表達(dá)，步驟同上。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-372在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87(1.85±0.12)、U251(2.36±0.27)、SHG-44(1.64±0.15)中miR-372表達(dá)水平高于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA(1.00±0.09)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、SHG-44中miR-372表達(dá)水平顯著低于膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251。miR-372在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。選用膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-372 inhibitor下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中miR-372表達(dá)水平 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中轉(zhuǎn)染miR-372 inhibitor，細(xì)胞中的miR-372表達(dá)水平顯著下降，見表1。

2.3下調(diào)miR-372提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中BTG1蛋白表達(dá) 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中轉(zhuǎn)染miR-372 inhibitor，細(xì)胞中BTG1蛋白水平顯著升高，見表1和圖1。

表1 miR-372 inhibitor轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中miR-372及BTG1蛋白水平比較

圖1 Western印跡檢測miR-372 inhibitor轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中的BTG1蛋白表達(dá)

2.4下調(diào)miR-372抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中轉(zhuǎn)染miR-372 inhibitor，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平顯著下降，見表2。

表2 miR-372 inhibitor轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251培養(yǎng)液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平

2.5miR-372靶向調(diào)控BTG1蛋白表達(dá) 生物學(xué)信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)miR-372與BTG1的3′UTR端結(jié)合位點(diǎn)，通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)BTG1受到miR-372的靶向調(diào)控作用，見圖2和表3。

圖2 miR-372與BTG1的3′UTR端結(jié)合位點(diǎn)

表3 熒光素酶活性

2.6BTG1 siRNA逆轉(zhuǎn)下調(diào)BTG1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251分泌TGF-β1、VEGF、IL-8 與共轉(zhuǎn)染miR-372 inhibitor和siRNA control的細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251培養(yǎng)液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平顯著升高，細(xì)胞中BTG1蛋白表達(dá)水平顯著下降，見圖3和表4。

1～2：Anti-miR-372+si-NC組、Anti-miR-372+si-BTG1組圖3 Western印跡檢測miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA共轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中BTG1蛋白水平

表4 miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA共轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中BTG1蛋白水平和分泌TGF-β1、VEGF、IL-8水平

3 討 論

miRNA是近些年來發(fā)現(xiàn)的單鏈RNA，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過1 000多種miRNA，miRNA可以通過特異性的識別靶標(biāo)進(jìn)而調(diào)控靶mRNA的表達(dá)〔10〕。研究表明，miRNA與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮類似癌基因或者是抑癌基因的作用，miRNA參與腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及腫瘤免疫逃逸過程〔11，12〕。miR-372是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤進(jìn)展關(guān)系十分密切的調(diào)節(jié)因子，其參與腫瘤細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移等過程，并且在不同的腫瘤中的作用不同〔13〕。在白血病、肺癌、肝癌等腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)miR-372表達(dá)上調(diào)，miR-372具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展作用，下調(diào)miR-372表達(dá)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和生長〔5，6,14〕。在卵巢癌中的研究表明，miR-372可以下調(diào)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)能力，miR-372在卵巢癌中扮演抑癌基因的作用〔7〕。研究顯示，miR-372在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，其可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生長和轉(zhuǎn)移，miR-372表達(dá)上調(diào)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差有關(guān)〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，miR-372在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，這與之前的研究結(jié)果相符合，均提示miR-372在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，miR-372在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮類似癌基因的作用。

腫瘤免疫逃逸是近些年來研究的熱點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞能夠合成并分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移〔15〕。TGF-β1、VEGF、IL-8是腫瘤發(fā)生過程中的促進(jìn)因子，能夠誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸發(fā)生，其在腫瘤組織中表達(dá)水平異常升高〔16，17〕。本研究顯示，下調(diào)miR-372后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的TGF-β1、VEGF、IL-8減少，提示下調(diào)miR-372可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子，miR-372可能通過參與腫瘤免疫逃逸過程介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展。

miRNA是一種新型的基因調(diào)節(jié)劑，其可以調(diào)控mRNA的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用〔18〕。miRNA通過影響不同的靶mRNA的翻譯而調(diào)控機(jī)體發(fā)育，并且同一個miRNA可以通過影響不同的靶基因表達(dá)而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用〔19，20〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，miR-372靶向調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中BTG1表達(dá)，BTG1可能是miR-372影響膠質(zhì)瘤進(jìn)展的機(jī)制之一。BTG1屬于BTG/Tob家族成員之一，其是在研究B型淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)的，BTG1具有抗細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，與很多腫瘤如肝癌、胃癌、胰腺癌等的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，BTG1在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮類似抑癌基因的作用〔21～23〕。在膠質(zhì)瘤中研究顯示，BTG1可以作為一種抑癌基因成為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)〔24〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)BTG1可以抑制下調(diào)miR-372對膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的抑制作用，提示下調(diào)miR-372通過靶向調(diào)控BTG1表達(dá)參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子過程。

綜上，miR-372在膠質(zhì)瘤免疫逃逸中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，下調(diào)miR-372抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控BTG1的表達(dá)有關(guān)。在以后研究中會繼續(xù)探討miR-372在腫瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機(jī)制。