NERP-1對(duì)大鼠下丘腦室旁核MNCs活動(dòng)的影響機(jī)制

金鑫 張智哲 邱德來(lái) 李玉子 初春平

(延邊大學(xué) 1附屬醫(yī)院心內(nèi)二療區(qū)，吉林 延吉 133000；2腦科學(xué)研究中心)

下丘腦室旁核(PVN) 是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要整合中樞，主要由分泌加壓素(VP)和催產(chǎn)素(OT)的神經(jīng)分泌大細(xì)胞(MNCs)、分泌促垂體激素和調(diào)控自主神經(jīng)活動(dòng)的神經(jīng)分泌小細(xì)胞組成〔1～3〕,其中MNCs分泌的VP和OT不僅在維持水鹽平衡、血壓調(diào)節(jié)、分娩和泌乳等生理功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，而且與社會(huì)行為關(guān)系密切，在親善關(guān)系、社會(huì)認(rèn)知、進(jìn)攻行為、焦慮和應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用〔4〕。

PVN MNCs從大腦廣泛的區(qū)域接收各種傳入信息，包括體液平衡和心血管狀態(tài)〔5〕，其中接收來(lái)至穹窿下器官(SFO)、自視前中央核(MNPO)、終板血管器(OVLT)、腦干核〔6〕和其他下丘腦內(nèi)核〔7〕的傳入纖維，這些傳入纖維包含興奮性谷氨酸〔8〕和抑制性γ-氨基丁酸(GABA)能投射〔9〕，通過(guò)釋放谷氨酸或GABA對(duì)PVN MNCs的活動(dòng)進(jìn)行興奮和抑制調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)PVN MNCs的分泌活動(dòng)〔8,9〕。

神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)肽(NERP)-1是近年來(lái)在人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞分離出的酰胺化肽，也是神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)所分泌的牛痘病毒生長(zhǎng)因子(VGF)衍生物〔10～12〕。NERP-1在PVN中含量豐富，存在于NMCs的分泌顆粒中，與VP和OT共存〔13,14〕。NERP-1還存在于其他腦區(qū)，如視上核(SON)、弓狀核(ARC)、外側(cè)下丘腦(LH)、腹側(cè)結(jié)節(jié)-基底膜核、視交叉上核、大腦皮層、垂體、甲狀腺和胃腸道〔15～17〕。側(cè)腦室給予抗NERP-IgGS可抑制由水負(fù)荷引起的血漿VP減少， 表明NERP可能是一種有效的內(nèi)源性VP釋放抑制因子，提示NERP-1在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在下丘腦PVN中的NERP-1與VP與OT共存，提示NERP-1可能影響PVN MNCs活動(dòng)與突觸傳遞，參與調(diào)節(jié)MNCs的分泌功能。側(cè)腦室或下丘腦外側(cè)區(qū)注射NERP-2能增加大鼠攝食、耗氧量和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，提示NERP-2影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)，調(diào)節(jié)能量代謝〔18,19〕。此外，Toshinai等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，NERP-1可抑制PVN MNCs的興奮性，導(dǎo)致MNCs超極化，放電頻率降低，但NERP-1抑制PVN MNCs興奮性的突觸機(jī)制尚不清楚。本文旨在探討NERP-1對(duì)大鼠PVN神經(jīng)分泌大細(xì)胞活動(dòng)影響的突觸機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心獲得，與母鼠共同飼養(yǎng)出生2～3周齡的雄性Wistar系大鼠。實(shí)驗(yàn)全部按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的動(dòng)物保護(hù)條例進(jìn)行，并由延邊大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)監(jiān)督。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 Multiclamp 20OB膜片鉗放大器(Molecular Devices，USA)，Nikon LV-TV膜片鉗專用顯微鏡(Nikon，Japan)，Clampex 10.4記錄和分析軟件(Molecular Devices，USA)，Digital1550AD/A數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Molecular Devices，USA)，Picospritzer1 壓力注射系統(tǒng)(Parker Hannifin Co.Pine Brook,NJ)，MP-285微操縱器(Sutter Instrument,Novato,USA)，Gilson Minipulse 3蠕動(dòng)泵(Villiers,Le BelFrance)，萊卡1200S全自動(dòng)振動(dòng)切片機(jī)(Leica，Germany)PB-10拉制儀(Narishige，Japan)，電子天平(Sartorius，Germany)，精密臺(tái)式PH測(cè)定儀(Thermo，USA)，Westor 5520露點(diǎn)滲壓儀(Westor，USA)，MASTER8刺激器(A.MP.L.)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品 (1)KCl、NaHCO3、NERP-1、Picrotoxin，tetrodotoxin (TTX)，D-Glucose，KT5720，PKI，NaH2PO4·2H2O，Na2HPO3·12H2O等試劑訂購(gòu)于Sigma公司。(2)人工腦脊液(ACSF)：10 mmol/L D-glucose，125 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，25 mmol/L NaHCO3，1 mmol/L MgSO4，1 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2。(3)電極內(nèi)液：1 mmol/L EGTA，5 mmol/L KCl，120 mmol/L potassium gluconate，4 mmol/L NaCl，8 mmol/L biocytin，10 mmol/L HEPES，3.5 mmol/L MgCl2，4 mmol/L Na2ATP，0.2 mmol/L Na2GTP(pH：7.3 )。(4)生物素染色試劑：磷酸鹽緩沖液，40% H2O2，ABC試劑盒，Triton100。

1.4下丘腦急性腦片制備 選取本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供的與母鼠共同飼養(yǎng)的Wistar雄性大鼠(出生后2～3 w)，使用異氟烷吸入麻醉，待動(dòng)物深度麻醉后迅速斷頭、取出腦組織。隨后將取出的腦組織置于充有混合95% O2和5%CO2氣體的冰冷ACSF中。ACSF含有的成分包括：NaCl(118 mmol/L),NaHCO3(25 mmol/L),D-Glucose(10 mmol/L),KCl(3 mmol/L),CaCl2(2 mmol/L)，MgCl 2.6H2O(1 mmol/L),NaH2PO4·2H2O(1 mmol/L)。滲透壓為295～300 mOsM，pH值為7.25～7.35。應(yīng)用振動(dòng)切片機(jī)制備厚度為250 μm，含有PVN的下丘腦切片。在室溫(24～25℃)條件下，將切片置于持續(xù)充有混合氣體(95% O2和5% CO2)的ACSF中孵育1 h以上。

1.5全細(xì)胞膜片鉗記錄 使用微電極拉制儀(PB-10，Narishige，Japan)將細(xì)小玻璃管(外徑:1.5 mm，Narishige，Japan)拉制成刺激電極和記錄電極。在記錄電極內(nèi)注入10 μl電極內(nèi)液，其組分包括：120 mmol/L Potassium Gluconate,8 mmol/L biocytin,5 mmol/L KCl,4 mmol/L Na2ATP，1 mmol/L EGTA,4 mmol/L NaCl，10 mmol/L HEPES,0.2 mmol/L Na2GTP,3.5 mmol/L MgCl2，pH值為7.3。記錄電極的阻抗為3～7 MΩ。在電流鉗下，觀察神經(jīng)元的自發(fā)性放電活動(dòng)，研究灌流NERP-1對(duì)PVN MNCs區(qū)域神經(jīng)元的自發(fā)性放電頻率、靜息膜電位和細(xì)胞膜特性的影響。在電壓鉗下，觀察自發(fā)性的微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)，觀察NERP-1對(duì)MNCs mEPSC的影響。只有完整記錄并基線相對(duì)穩(wěn)定的電生理數(shù)據(jù)才能用于最后的數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在實(shí)驗(yàn)室的電腦和移動(dòng)硬盤上。NERP-1、電壓依存性鈉離子通道阻斷劑河豚毒素(TTX)、非選擇性谷氨酸受體阻斷劑犬尿喹啉酸(KYC)、GABAA受體阻斷劑Picrotoxin通過(guò)蠕動(dòng)泵給藥。

1.6生物素染色 膜片鉗電極內(nèi)液中含有8%的生物素，電生理實(shí)驗(yàn)記錄所用的腦切片用4%多聚甲醛進(jìn)行固定24 h以上后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(ABC Elitekit)、封片、顯微照相，在顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞的位置、形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及軸突和樹突的分布與投射情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 神經(jīng)元的自發(fā)性放電頻率的分析使用Clampfit10.4軟件，mEPSCs的分析采用MiniAnalysis (6.0)軟件。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PVN MNCs的電生理一般特征 在電流鉗記錄模式下，共有63個(gè)所記錄細(xì)胞符合MNCs電生理特性，被認(rèn)定為PVN MNCs，這些神經(jīng)元對(duì)注入電流表現(xiàn)出明顯的外向整流特征，見圖1。在電生理實(shí)驗(yàn)記錄結(jié)束后進(jìn)行固定、染色，在顯微鏡下觀察到胞體、軸突和樹突符合MNCs特征，將其確定為MNCs。

圖1 MNCs的電生理特性

2.2NERP-1對(duì)PVN MNCs自發(fā)性放電活動(dòng)的影響 在電流鉗記錄模式下(I=0 pA)，灌流100 nmol/L NERP-1，持續(xù)2 min，PVN MNCs的自發(fā)性放電活動(dòng)頻率顯著降低，NERP-1的抑制作用大概在給藥5 min后達(dá)到峰值，用ACSF沖洗后逐漸恢復(fù)至用藥前的自發(fā)性動(dòng)作電位的放電水平(圖2A、B)。100 nmol/L的NERP-1可以導(dǎo)致MNCs的放電頻率降低至(34.5±4.14)%，膜電位從(-50.0±1.1)mV超極化到(-53.1±1.4)mV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2C。

2.3離子型谷氨酸受體阻斷劑對(duì)NERP-1導(dǎo)致PVN MNCs自發(fā)性放電頻率降低的影響 在電流鉗下，給予KYC可導(dǎo)致PVN MNCs放電頻率明顯降低(P<0.05)，并完全阻斷NERP-1對(duì)MNCs的抑制作用。在KYC存在下，給予NERP-1沒(méi)有對(duì)神經(jīng)元的自發(fā)性活動(dòng)產(chǎn)生顯著影響，與單獨(dú)給予KYC相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。見圖3。

2.4GABAA受體阻斷劑對(duì)NERP-1導(dǎo)致PVN MNCs自發(fā)性放電頻率降低的影響 阻斷GABAA受體后，PVN MNCs的自發(fā)性放電頻率顯著增加(P<0.05)，但沒(méi)有阻斷NERP-1對(duì)PVN MNCs的自發(fā)性放電的影響，見圖4。

2.5NERP-1對(duì)PVN MNCs興奮性谷氨酸能突觸傳遞的影響 在電壓依存性鈉離子通道阻斷劑(TTX，0.5 μmol/L)存在條件下，給予100 nmol/L NERP-1后可以明顯降低MNCS 的mEPSCs頻率，導(dǎo)致mEPSCs間隔顯著增大，EPSCs概率-頻率曲線右移(圖5A,B);但mEPSCs的振幅較給藥前后沒(méi)有顯著變化，概率-振幅曲線變化不明顯(圖5A、C)。NERP-1可導(dǎo)致MNCs mEPSCs頻率減少到給藥前的〔(63.4±3.6)%〕，與給藥前〔(100.0±4.7 )%〕相比有顯著差異(P<0.01)，但NERP-1對(duì)mEPSCs的振幅沒(méi)有顯著影響，振幅為給藥前的〔(97.7±1.2)%,P<0.05〕。

(A)在電流鉗記錄模式下，PVN MNCs自發(fā)性放電頻率的變化。(B)NERP-1誘導(dǎo)PVN MNCs放電頻率變化的時(shí)程。(C)ACSF、NERP-1、洗出時(shí)PVN MNCs的膜電位的比較圖2 NERP-1對(duì) PVN MNCs的自發(fā)性放電活動(dòng)的影響

圖3 離子型谷氨酸受體拮抗劑對(duì)NERP-1誘導(dǎo)的PVN MNCs放電頻率降低的影響

圖4 GABAA受體阻斷劑對(duì)NERP-1導(dǎo)致PVN MNCs自發(fā)性放電頻率降低的影響

(A)電壓鉗記錄模式下，在ACSF、NERP-1和洗出條件下記錄PVN MNCs mEPSCs。(B)ACSF、NERP-1和洗出中PVN MNCs的累積概率-頻率曲線。(C)ACSF、NERP-1和洗出中PVN MNCs的累積概率-振幅曲線圖5 在TTX存在條件下，NERP-1對(duì)MNCs mEPSC的影響

3 討 論

NERP-1在PVN中含量豐富，與VP和OT共存，在調(diào)節(jié)水鹽代謝和VP釋放方面起至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄和神經(jīng)藥理學(xué)手段研究了NERP-1對(duì)PVN NMCs影響的突觸機(jī)制，發(fā)現(xiàn)給予NERP-1可導(dǎo)致PVN MNCs放電頻率顯著降低并伴隨明顯的膜電位超極化，NERP-1導(dǎo)致的MNCs的放電頻率降低可以被非選擇性離子型谷氨酸受體拮抗劑KYC，但對(duì)GABAA受體阻斷劑不敏感，此外，NERP-1顯著降低MNCs的mEPSCs發(fā)生頻率，但對(duì)其振幅沒(méi)有顯著影響。本研究結(jié)果表明NERP-1 通過(guò)突觸前途徑下調(diào)興奮性谷氨酸能傳入纖維終端的遞質(zhì)釋放，降低下丘腦PVN神經(jīng)分泌大細(xì)胞的興奮性，提示NERP-1通過(guò)間接方式抑制PVN MNCs的活動(dòng)與分泌。

下丘腦PVN主要由分泌VP和OT的神經(jīng)分泌大細(xì)胞、分泌促垂體激素和調(diào)控自主神經(jīng)活動(dòng)的神經(jīng)分泌小細(xì)胞組成，是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要整合中樞〔1～3〕。PVN MNCs主要包括VP和OT神經(jīng)元，分泌VP、OT等多種激素和生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)和維持機(jī)體的許多重要生理功能。VP和OT主要參與維持水鹽平衡、血壓調(diào)節(jié)、分娩和泌乳等機(jī)體功能調(diào)節(jié)，且在親善關(guān)系、社會(huì)認(rèn)知、進(jìn)攻行為、焦慮和應(yīng)激反應(yīng)中都起重要作用〔4〕。而NERP-1在PVN MNCs的分泌顆粒中與VP和OT共同存在，而這些MNCs的軸突終止于垂體后葉，垂體后葉中的NERP-1、VP和OT亦可分泌到全身循環(huán)中，調(diào)節(jié)水鹽代謝，參與血壓調(diào)節(jié)及分娩和泌乳等機(jī)體功能，參與親善關(guān)系、社會(huì)認(rèn)知、進(jìn)攻行為、焦慮和應(yīng)激反應(yīng)〔13,14〕。

NERP是一種參與體液內(nèi)穩(wěn)態(tài)的新型生物活性肽，以自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌方式調(diào)節(jié)其他神經(jīng)肽的作用和分泌。NERP-1在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、水鹽代謝、攝食、能量代謝及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起不可忽視的作用。側(cè)腦室注射高滲鹽水或血管緊張素Ⅱ可提高大鼠血漿VP水平，而這種作用可以被側(cè)腦室注射NERP-1抑制。此外，側(cè)腦室注射NERP-1 IgG抗體可以逆轉(zhuǎn)急性水負(fù)荷引起的血漿VP抑制，提示NERP是調(diào)節(jié)VP分泌的內(nèi)源性肽。大鼠下丘腦切片實(shí)驗(yàn)表明，NERP-1可逆地抑制了VP分泌和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VP分泌，但NERP-1-Gly和NERP-2-Gly不能抑制VP的分泌。分泌VP的MNCs將軸突投射到垂體后葉并進(jìn)入到全身的循環(huán)系統(tǒng)中。NERPs 還可以抑制大鼠垂體后葉的VP分泌，因此，NERPs 可能是VP分泌的內(nèi)源性抑制因子〔21,22〕。

已有研究發(fā)現(xiàn)NERP-1可通過(guò)抑制谷氨酸能神經(jīng)元向PVN神經(jīng)分泌大細(xì)胞的釋放從而抑制MNCs的興奮性，但其突觸機(jī)制尚不明確〔20〕。本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察了NERP-1對(duì)PVN MNCs突觸傳遞的影響。研究結(jié)果與前期報(bào)道〔20〕相一致，發(fā)現(xiàn)NERP-1可引起PVN MNCs抑制，出現(xiàn)放電頻率降低。應(yīng)用了離子型谷氨酸受體阻斷劑KYC，結(jié)果提示局部蠕動(dòng)灌流NERP-1顯著降低PVN MNCs的放電頻率是通過(guò)抑制興奮性谷氨酸能突觸傳入來(lái)實(shí)現(xiàn)的。給予了GABAA受體阻斷劑Picrotoxin，結(jié)果提示NERP-1 引起PVN MNCs放電頻率的降低是通過(guò)抑制興奮性谷氨酸能突觸傳入而并非通過(guò)增強(qiáng)GABA能突觸傳入來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在電壓依存性鈉離子通道阻斷劑TTX的存在下，NERP-1可以明顯降低敏感神經(jīng)元mEPSCs的頻率，但對(duì)mEPSCs振幅較沒(méi)有顯著影響，提示NERP-1可通過(guò)降低突觸前神經(jīng)元末梢的興奮性谷氨酸能突觸傳遞的這一可能性，從而抑制對(duì)部分PVN MNCs的興奮性。

綜上，NERP-1可顯著抑制PVN MNCs的放電頻率并伴隨明顯的膜電位超極化，NERP-1導(dǎo)致放電頻率降低可以被非選擇性離子型谷氨酸受體拮抗劑阻斷，但對(duì)GABAA受體阻斷劑不敏感，NERP-1 通過(guò)突觸前途徑抑制興奮性谷氨酸能傳入纖維終端的遞質(zhì)釋放，降低下丘腦PVN NMCs的興奮性，提示NERP-1間接抑制PVN MNCs的活動(dòng)與分泌。