高效液相色譜法測定液態(tài)乳中乳果糖方法的優(yōu)化

李盛楠，張敏婕，胡浩鑫，馮沛彥，曾 靜，韋曉群，3，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州210095;2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興527400;3.廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣東廣州510656)

非天然存在的乳果糖(Lactulose)由一分子半乳糖和一分子果糖組成，是生牛乳中乳糖經(jīng)熱處理后堿基異構(gòu)化而形成的雙糖產(chǎn)物［1］。生牛乳經(jīng)不同工藝熱處理后的液態(tài)乳中乳果糖含量差異明顯［2］。因此，可以通過乳果糖含量評價液態(tài)乳在熱加工處理中的受熱強(qiáng)度從而監(jiān)測產(chǎn)品在熱加工過程中的質(zhì)量變化［3－5］。

隨著檢測儀器與方法的不斷改進(jìn)，高效液相色譜法(HPLC)以其簡便的操作方法和較高分辨率與精密度，逐漸代替酶解比色法成為乳果糖含量檢測的主要方法［6－9］。乳果糖與乳糖互為同分異構(gòu)體［10］且經(jīng)熱處理后在液態(tài)乳中含量相差較大，通常乳糖濃度高于乳果糖濃度三個數(shù)量級［11］，因而導(dǎo)致兩者在色譜柱上分離效果不佳，進(jìn)而影響乳果糖準(zhǔn)確定量［12－13］。除此之外，受色譜柱上功能基團(tuán)化學(xué)穩(wěn)定的影響，采用高效液相色譜法對進(jìn)行乳果糖定量時可能會產(chǎn)生誤差［14］，目前用于乳果糖高效液相檢測的色譜柱主要以糖基柱［15－16］和氨基柱［17－19］為主，雖然它們能滿足液態(tài)乳中乳果糖的檢測分離需求，但從長期檢測出發(fā)，兩種色譜柱上的功能基團(tuán)較易損耗，進(jìn)而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確。Manzi等［20］采用兩根氨基柱對乳果糖進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)氨基柱上的氨丙基硅烷極性基團(tuán)極易受鹽離子干擾，并與待測糖形成薛夫堿(Schiff)，導(dǎo)致定量結(jié)果偏低，同時王桂云等［21］利用氨基柱測定幾種還原糖時發(fā)現(xiàn)氨基柱的鍵合官能團(tuán)氨丙基易水解，柱流失嚴(yán)重色譜柱壽命短。Silveira等［15］應(yīng)用糖分析柱對乳果糖進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)糖基柱中的分離因子磺酸鹽自由基(R－SO－3)極易與Ca2+產(chǎn)生電荷效應(yīng)，導(dǎo)致柱效降低使待測物各組分保留時間漂移影響定量效果。

改性酰胺柱［22］作為一種化學(xué)性質(zhì)的色譜柱，其中酰胺基可與不同糖醇或者糖醛基形成氫鍵作用性質(zhì)穩(wěn)定，且難以與糖基鍵合形成希夫堿(Schiff)，避免了樣品中乳果糖濃度損失，柱流失減少，使用壽命增長，理論上可作為一種乳果糖日常分析檢測的分離柱，但考慮到在檢測乳果糖時其他二糖也可能與酰胺柱上的活性基團(tuán)鍵合從而對乳果糖色譜峰產(chǎn)生干擾因而目前在乳果糖的高效液相色譜分離定量中未見良好應(yīng)用。

本文擬使用化學(xué)穩(wěn)定的改性酰胺基色譜柱，通過改變進(jìn)樣條件使液態(tài)乳中高含量乳糖與低含量乳果糖分離滿足定量要求，并且通過探究不同單糖及雙糖在改性酰胺基色譜柱上的保留時間規(guī)律，尋找對乳果糖色譜分離產(chǎn)生干擾的二糖并提出解決方法，從而建立起一種基于高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC－ELSD)更加經(jīng)濟(jì)簡便、定量準(zhǔn)確的日常乳果糖定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳果糖(C12H22O11，CAS No.:4618－18－2)標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥99%，北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖淀粉酶 活度2000 U/mL，中國上海ANPEL實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司;乙腈(色譜級)美國Thermo Fisher公司;甲醇(MeOH)、乙酸(HAC)分析純，廣州化學(xué)試劑廠;超純水 離子交換系統(tǒng)制備，電阻率＞18 mΩ，中國廣州實(shí)驗(yàn)室;27種牛奶實(shí)際樣本 廣州永旺百貨超市。

高效液相色譜儀(島津Nexera HPLC LC－30A配蒸發(fā)光散射檢測器) 日本島津公司;Acchrom Xamide色譜柱(5μm，4.6 mm×250 mm)日本島津公司;5804R高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;R2010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海霓玥儀器有限公司;HC1204分析天平(精度0.1 mg)上?；ǔ睂?shí)業(yè)有限公司;W－201B恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取2.5 g乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品溶于水中，用水稀釋至25 mL，制成100000 mg/L的乳果糖儲備液，2～4℃保存，有效期為3個月。1 mL的100000 mg/L乳果糖儲備液轉(zhuǎn)移至樣品瓶，用緩沖溶液稀釋至10 mL，制成10000 mg/L乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，2～4℃保存，有效期為3個月。

1.2.2 樣品前處理 精確量取24 mL樣品(牛奶)于50 mL離心管，加入1 mL乙酸，振搖2 min，以10000 r/min離心，定量濾紙過濾，所得濾液采用0.22μm濾膜過濾后取1 mL于進(jìn)樣小瓶，上機(jī)分析。若檢測樣品經(jīng)色譜分離發(fā)現(xiàn)乳果糖色譜峰被麥芽糖色譜峰所干擾，考慮在樣品前處理離心后加入0.2 mL葡萄糖淀粉酶，45℃酶解3 h，酶解產(chǎn)物經(jīng)0.22μm濾膜過濾，取1 mL于進(jìn)樣小瓶，上機(jī)分析;若樣品中乳果糖的含量較低，則在離心后70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10倍，后過膜分析。

1.2.3 液相色譜條件 流動相A相:水－B相:乙腈;洗脫程序:17%A(0～25 min)，80%A(25.1～30 min)，17%A(30.1～40 min)梯度洗脫40 min;色譜柱:Acchrom X－amide(5μm，250 mm×4.6 mm);柱溫:25℃;平衡時間:12 min;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:3μL;檢測器:蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0，色譜采集及處理采用島津液相色譜儀配套的LC Solution色譜處理系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳果糖與乳糖的分離

當(dāng)乳糖濃度遠(yuǎn)高于乳果糖濃度3個數(shù)量級時以常規(guī)體積進(jìn)樣，二者分離效果不佳［23－24］。楊朝輝［25］研究表明當(dāng)樣品濃度一定時進(jìn)樣體積會對色譜峰寬以及分離度產(chǎn)生影響，因而本實(shí)驗(yàn)改變進(jìn)樣量(1、3、4、6、8、10、15μL)試圖改善乳果糖和乳糖的分離效果。色譜分離的有效性由分辨率表示，即兩個相鄰峰的保留時間差與平均峰寬之比。R越大，兩個相鄰成分的分離效果越好。通常，當(dāng)R＜1時，兩個峰之間有一些重疊;當(dāng)R=1.0時，稱為4σ分離，兩個峰大部分分離，分離度可達(dá)到98%;當(dāng)R=1.5時，稱為6σ分離，分離度可以達(dá)到99.7%。R=1.5通常用作兩個相鄰峰已完全分離的標(biāo)記［26］。結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量從1μL增至15μL時，分離度從2.2降至0.9(圖1)，進(jìn)樣體積越小，乳果糖與乳糖分離度越高。大體積進(jìn)樣會造成色譜柱超載，柱效降低，導(dǎo)致峰寬增加分離度降低。因此，降低進(jìn)樣體積可將液態(tài)乳中乳糖與乳果糖的有效分離。

圖1 進(jìn)樣量對分離度的影響Fig.1 Effect of injection volume on resolution

本實(shí)驗(yàn)最終以3μL色譜進(jìn)樣分析，此時乳果糖與果糖分離度R=1.6。兩個色譜峰被完全分開(圖2)滿足定量檢測峰面積積分要求。

圖2 乳果糖與乳糖的色譜分離圖Fig.2 Chromatographic separation of lactulose and lactose

2.2 其他二糖分離干擾的排除

黃曉林等［27－28］研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)純牛奶中只含乳糖和乳果糖，但部分液態(tài)乳中會添加蔗糖、麥芽糖等雙糖以增加風(fēng)味，其中部分雙糖因會與色譜柱上的酰胺基鍵合從而干擾乳果糖在色譜柱上的分離。本實(shí)驗(yàn)將通過半乳糖、葡萄糖、果糖等單糖及其組合雙糖的保留時間規(guī)律探究干擾乳果糖分離的雙糖。結(jié)果顯示(圖3)，單糖的保留時間順序依次為果糖、葡萄糖和半乳糖，而其組合雙糖的保留時間順序依次為蔗糖(果糖－葡萄糖)、乳果糖(果糖－半乳糖)和乳糖(葡萄糖－半乳糖)。表明不同濃度流動相下雙糖的保留時間順序與其單糖分子的保留時間順序相同，據(jù)此推測乳制品中所含的麥芽糖(葡萄糖－葡萄糖)的保留時間則可能與乳果糖(果糖－半乳糖)的色譜保留時間相同或者接近從而干擾乳果糖在色譜柱上的分離測定。為進(jìn)一步驗(yàn)證以上推論，使用改性酰胺基色譜柱(5μm，4.6 mm×250 mm)，并以乙腈－水(83%～17%)為流動相，1 mL/min流速洗脫30 min。結(jié)果顯示(圖4)，乳果糖(Rt=18.9 min)與蔗糖(Rt=16.6 min)、乳糖(Rt=21.0 min，22.2 min)很好地被明顯地分離，麥芽糖(Rt=19.7 min，21.0 min)中α－麥芽糖色譜保留時間與乳果糖(Rt=18.9 min)接近，色譜圖顯示兩者未見分離，此時R=0.7，符合上述對于麥芽糖在改性酰胺基色譜柱上可能會對乳果糖的分離產(chǎn)生干擾的推測。

圖3 不同流動相下不同糖的的保留時間變化Fig.3 Changes of the retention time of different sugars at various mobile phase

圖4 相同條件下麥芽糖與乳果糖保留時間對照Fig.4 Comparison of retention time of maltose and lactulose under the same chromatographic condition

為進(jìn)一步驗(yàn)證麥芽糖在改性酰胺基色譜柱上的干擾，應(yīng)用ChemDraw 3D軟件通過能量最小化計(jì)算三個酰胺基與麥芽糖(圖5a)和乳果糖(圖5b)形成氫鍵的類型與數(shù)量。計(jì)算結(jié)果顯示兩種糖都可以與色譜柱上的三個酰胺基形成4個NH－OH氫鍵，2個C=O－OH氫鍵，證明麥芽糖(Rt=19.7 min)和乳果糖(Rt=18.9 min)在改性酰胺基色譜柱上保留時間相近，當(dāng)麥芽糖和乳果糖同時存在時幾乎不可能實(shí)現(xiàn)基線分離。因此，若經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)樣品中存在麥芽糖時可考慮在樣品前處理中加入葡萄糖淀粉酶［29］試圖將麥芽糖水解為葡萄糖，以消除α－麥芽糖對乳果糖的色譜峰干擾。

圖5 3D建模Fig.5 3D modeling

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)將乳果糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度依次稀釋為50、100、250、500、1000、2500 mg/L，并換算為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以乳果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)(X，mg/kg)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y)，得線性方程Y=1849.1X－52528，該線性在50～2500 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9997。

表1 三個水平下乳果糖濃度的回收率和精密度Table 1 Recoveries and RSDs of lactulose concentration at three levels

表2 市售牛奶中乳果糖的測定結(jié)果Table 2 Results of determination of lactulose in milk sold on the market

逐步稀釋乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度當(dāng)乳果糖峰高為基線噪音高3倍和10倍時，檢測限與定量限分別為15和50 mg/kg。

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度 本方法通過在液體中加標(biāo)方法測定回收率的方法來驗(yàn)證方法的正確度。方法選擇1倍定量限、20倍定量限、200倍定量限三個水平進(jìn)行回收率試驗(yàn)，即樣品總添加濃度為50、100和1000 mg/kg，覆蓋NY/T939－2016中100～600 mg/kg的范圍。每個加標(biāo)水平測定6次。乳果糖的加標(biāo)回收率在90.3%～105.6%之間，RSD低于5%，在3.4%～3.9%之間變化(表1)，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，符合分析要求。

2.4 樣品檢測

根據(jù)田瑤［13］對液態(tài)乳中乳果糖含量研究表明，高溫巴氏殺菌乳中的乳果糖的濃度范圍在6.7～80 mg/L，UHT滅菌乳中乳果糖質(zhì)量濃度為50～1065.1 mg/L，直接UHT滅菌乳中乳果糖質(zhì)量濃為50～850 mg/L，間接UHT滅菌乳中乳果糖質(zhì)量濃度為190～1065.1 mg/L，因而采用本方法對10種高溫巴氏滅菌牛奶樣品和17種UHT牛奶樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，所有檢測結(jié)果均在可控合理的范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)穩(wěn)定的改性酰胺基色譜柱完善了液態(tài)乳中乳果糖含量的高效液相色譜(HPLC)分析方法。通過探究不同進(jìn)樣體積對色譜的分離效果以及不同流動相比例下單糖的色譜出峰規(guī)律首先發(fā)現(xiàn)降低進(jìn)樣體積有利于提高乳果糖和乳糖的色譜分離，其次發(fā)現(xiàn)α－麥芽糖會對乳果糖的色譜峰產(chǎn)生干擾，因而考慮在樣品前處理時加入葡萄糖淀粉酶排除α－麥芽糖的色譜干擾。最終經(jīng)優(yōu)化后的方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，乳果糖在50～2500 mg/kg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9997，乳果糖檢出限與定量限分別為定量限為15和50 mg/kg加標(biāo)回收率在90.3%～105.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0%～3.9%。運(yùn)用該方法對市場中的27種實(shí)際乳樣進(jìn)行分析結(jié)果顯示，乳果糖的檢測含量均在合理范圍內(nèi)。本方法為液態(tài)乳中乳果糖的日常檢測提供了一種更加簡便經(jīng)濟(jì)，靈敏準(zhǔn)確的途徑，有利于業(yè)界以對液態(tài)乳加工質(zhì)量準(zhǔn)確評價。