分散固相萃取-GC-MS法測定海產(chǎn)品中9種有機(jī)錫化合物

王 姮，胡紅美，郭遠(yuǎn)明，金衍健，楊承虎

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316021)

有機(jī)錫化合物(organotin compounds，OTs)是一類錫與碳元素結(jié)合的金屬有機(jī)化合物，常在工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被用作殺蟲劑、除草劑和船舶的防污涂料。它們具有高毒性，其中三丁基錫(tributyhin，TBT)和三苯基錫(triphyltin，TPhT)在水中達(dá)到ng/L水平就能引發(fā)海產(chǎn)腹足類生物的雌性不育甚至種群滅絕［1］。同時，OTs易富集于海洋生物的內(nèi)臟、性腺和鰓中，具有一定的生物富集性［2］，研究表明，有機(jī)錫在魚類、貝類等生物體內(nèi)生物濃縮系數(shù)(BCF)最高達(dá)8700000，并具有生物放大作用，一旦被人類食用，最終將威脅人類健康和生命。最近Chen等［3］研究中發(fā)現(xiàn)南方沿海地帶海產(chǎn)品中TPhT含量在246～1484 ng/g之間，說明我國南方沿海地區(qū)的海產(chǎn)品仍然存在嚴(yán)重的有機(jī)錫污染。在全國范圍內(nèi)，中國每年生產(chǎn)約200 t TPhT［4］。因此加強(qiáng)針對有機(jī)錫化合物的探究對保護(hù)環(huán)境和保障食品安全都很重要。

通常采用氣相色譜－質(zhì)譜法(GC－MS)［5－9］、氣相色譜－電感耦合等離子質(zhì)譜法［10－11］和氣相色譜－脈沖火焰光度法［12－15］等測定海產(chǎn)品中的有機(jī)錫化合物。此外還有高效液相色譜法與電感耦合等離子質(zhì)譜法聯(lián)用［16－17］、高效液相色譜－原子熒光光譜聯(lián)用法［18］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［19－20］、石墨爐原子吸收光譜法［21］等檢測方法。且采用氣相色譜法時還必須結(jié)合衍生技術(shù)，將有機(jī)錫化合物轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的物質(zhì)使其在分析過程中氣化但不分解。而相比氣相色譜法，液相法雖然無需衍生，但與其聯(lián)用的高靈敏檢測器較少［22］。由于GC－MS既有氣相色譜高效、快速的分離性能，又有質(zhì)譜準(zhǔn)確定性的優(yōu)勢，目前在海產(chǎn)品中有機(jī)錫化合物檢測中將具有更廣泛的應(yīng)用前景。

同時，不管選擇何種檢測方法，還需結(jié)合超聲波萃取、頂空單滴液相微萃取、固相微萃取、微波輔助提取、索氏提取等萃取技術(shù)和凝膠滲透色譜、固相萃取、層析柱凈化等凈化技術(shù)進(jìn)行樣品前處理。但采用凝膠滲透色譜凈化時洗脫溶劑用量較大，設(shè)備運(yùn)行成本高［23］;雖然層析柱的使用投入不大，但必須手動裝填，要用到大量的吸附劑而且重現(xiàn)性也很不理想;目前商品化的固相萃取小柱廣泛應(yīng)用于不同樣品的凈化過程，但還要進(jìn)行萃取柱活化、上樣、淋洗、洗脫等過程，較為費(fèi)時間和人力，不太適用于處理大量的樣品。Anastassiades等［24］在2003年提出了分散固相萃取技術(shù)，這是一種快速、高效的凈化技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品有機(jī)錫快速前處理提供了新思路。該凈化技術(shù)只需要通過振蕩和過膜等方式，直接將吸附劑添加至提取液中進(jìn)行凈化，還可以有效地除去水產(chǎn)品基質(zhì)中的干擾物，實(shí)現(xiàn)了樣品快速、簡便的凈化處理［25］，但目前該法在水產(chǎn)品中OTs前處理方面鮮有報道。因此，針對有機(jī)錫檢測存在前處理過程復(fù)雜等問題，本文開發(fā)了超聲波萃取、分散固相萃取凈化，GC－MS法同時檢測海產(chǎn)品中9種有機(jī)錫化合物的新方法，并對前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化，以滿足市場對靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N－丙基乙二胺(Primary secondary amine，PSA，粒徑40～63μm)，C18(粒徑40～63μm)、硅膠吸附劑(Si，粒徑40～46μm)、弗羅里硅土(Florisil，粒徑60～100目)、中性氧化鋁(Alumina－N，粒徑100～300目)、石墨化炭黑(Graphitized carbon black，GCB，粒徑120～400目)、四乙基硼化鈉(NaBEt4)上海安譜科學(xué)儀器有限公司;9種OTs標(biāo)準(zhǔn)品:具體內(nèi)容詳見表1，德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、醋酸、四氫呋喃、正己烷(色譜純)，銅粉(分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;環(huán)庚三烯酚酮(分析純)上海紫一試劑廠;實(shí)驗(yàn)用水 均為實(shí)驗(yàn)室自制二次蒸餾水;樣品(含魚類、貝類、蝦類、蟹類)均購自舟山市海產(chǎn)批發(fā)市場，共計12個樣品，用潔凈的食品級聚乙烯塑料袋裹住樣品后，立即用專用便攜冷藏裝置送至實(shí)驗(yàn)室。

7890B/5977A氣相色譜－質(zhì)譜儀 美國Agilent公司;VS22－500A超聲波萃取儀 無錫沃信儀器制造有限公司;Vortex4型渦旋振蕩器 德國IKA公司;SIGMA 8KS高速離心機(jī) 德國Sigma公司;ChristALPHA 1－2 LD plus冷凍干燥機(jī) 美國Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 9種OTs標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1000μg/L):加入甲醇溶液進(jìn)行配制，逐次稀釋后用甲醇定容，配出1000μg/L的混標(biāo)溶液，在4℃的溫度條件下儲放。

1.2.2 樣品制樣和保存 制樣時，將魚類樣品去除其外皮和鱗片，沿著其脊背取下肌肉部分;將蝦類和蟹類樣品去除其頭部、外殼和附肢部分，取其肌肉部分;將貝類樣品去除殼部，只取其可食用部分。樣品切為長寬高均不大于0.5 cm的大小，用樣品組織研磨機(jī)勻質(zhì)后在－55℃冷凝器溫度下冷凍干燥12 h(同時測定其含水率，便于最后實(shí)際樣品測定濃度也可以按濕重計)，取出后置于－18℃溫度條件下冷凍保存，待測。

1.2.3 樣品前處理 精確稱量1.2.2中1.00 g待測的樣品于50 mL離心管中，添加5 mL含0.03%環(huán)庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)，經(jīng)渦旋振蕩2 min后，以300 W功率在35℃的條件下連續(xù)超聲提取15 min，添加1～3 g銅粉進(jìn)行脫硫，3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取其上清液，再向樣品中添加5 mL含0.03%環(huán)庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)，重復(fù)如上操作后，將提取液收集于15 mL離心管后置于－80℃，冷凍脫脂2 h后，6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取出上清液到另一支15 mL離心管，再添入100 mg PSA固相吸附劑，渦旋振蕩1 min后，轉(zhuǎn)速6000 r/min下離心2 min，再取上清液到另一支50 mL離心管，添入40 mL醋酸－醋酸鈉緩沖溶液(1 mol/L，pH4.5～5)、1 g氯化鈉、5 mL正己烷后，渦旋振蕩后添入200μL含四乙基硼化鈉(10%)的四氫呋喃，振蕩15 min后，6000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心2 min，取出上層的正己烷相，并在正己烷相中添加200 mg用于脫水的無水硫酸鈉、100 mg GCB固相吸附劑，渦旋1 min，取上清液通過0.22μm的濾膜，最后在溫度38℃的水浴下，吹氮?dú)庹舭l(fā)到干，用正己烷進(jìn)行溶解，最后定容到200μL，用GC－MS進(jìn)行分析。

表1 9種OTs保留時間、定量離子、定性離子Table 1 Retention times，quantitative ions，and qualifier ions of 9 OTs

1.2.4 色譜條件 HP－35MS毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);載氣為高純氦氣(純度99.999%)，流量1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度260℃。進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣1μL;傳輸線溫度260℃。柱升溫程序:初始溫度60℃，保持1.0 min，以20℃/min升溫至220℃，保持10 min，最后以15℃/min升溫至280℃，保持5.0 min，總運(yùn)行時間28 min。

1.2.5 質(zhì)譜條件 離子源配置為電子轟擊(EI)，溫度為230℃，電離能量為70 eV;溶劑延遲時間為3 min;四極桿溫度為150℃，選擇離子SIM監(jiān)測;離子定量定性信息詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取方式的選擇

由于索氏提取、振蕩提取等常用方法在萃取時耗費(fèi)時間和人力，同時會用到許多對環(huán)境和人體有害的試劑?？焖偃軇┹腿『臀⒉ㄝ腿》ㄋ鑳x器設(shè)備價格較高。超聲波萃取法不僅能夠萃取出結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的OTs，同時還具有高效、儀器設(shè)備低廉、試驗(yàn)步驟簡捷等長處，目前已有一些研究運(yùn)用該法來萃取海產(chǎn)品中的有機(jī)錫［15，18，26］。綜上，本次研究決定對海產(chǎn)品的OTs采取超聲波萃取法。有機(jī)錫檢測中常用的萃取劑有正己烷［27］、甲醇［28］、鹽酸－甲醇(v/v，1∶1)［10］、醋酸－甲醇(v/v，1∶1)［16］、二氯甲烷［29］、正己烷－環(huán)庚三烯酚酮［30］等。在萃取劑中添加二乙基二硫基代氨基甲酸鈉(NaDDTC)［31］、環(huán)庚三烯酚酮［25］等常見的螯合劑，可以通過提升OTs在有機(jī)相中的溶解能力來提高超聲波萃取的效率。采用含環(huán)庚三烯酚酮的有機(jī)溶劑萃取OTs時可提高目標(biāo)化合物的溶解能力［32］，提高其萃取效率，且環(huán)庚三烯酚酮在0.01～0.5 g/100 mL的范圍內(nèi)萃取效率并無明顯差異。本方法最終選擇含0.03%環(huán)庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)溶液作為萃取劑。

2.2 凈化方式的選擇

色素和油脂是影響檢測海產(chǎn)品有機(jī)錫化合物的主要雜質(zhì)。采取凝膠滲透色譜和固相萃取小柱/層析柱聯(lián)合凈化是已有報道研究常用的凈化方式。本研究首次采用冷凍脫脂和衍生前后各進(jìn)行一次分散固相萃取進(jìn)行凈化，凈化效果較為顯著。其中冷凍脫脂技術(shù)相對簡捷，無需使用額外試劑及凝膠滲透色譜等大型儀器設(shè)備，且能除去相當(dāng)一部分脂肪，為后續(xù)進(jìn)行兩次分散固相萃取凈化奠定基礎(chǔ)。使用PSA固相吸附劑能去除干擾OTs檢測結(jié)果的脂肪酸、碳水化合物、糖類、酚類和部分極性色素的不利因子［33］，所以在衍生和反萃取之前，首先選擇PSA固相吸附劑進(jìn)行分散固相萃取凈化。而衍生后進(jìn)行第二次分散固相萃取凈化時，比較了C18、PSA、GCB等固相吸附劑的分散固相萃取凈化效果(圖1)，結(jié)果顯示運(yùn)用GCB進(jìn)行吸附后提取液基本呈無色透明，9種OTs的回收率較高(75.4%～118.2%)。因此本研究采用GCB作為第二次分散固相萃取凈化的吸附劑。

圖1 不同吸附劑對萃取效果的影響Fig.1 The effect of different adsorbents on extraction efficiency

2.3 衍生條件的選擇

使用GC法檢測OTs時通常要進(jìn)行衍生。有機(jī)錫的衍生主要包括使用Grignard試劑(含鹵化鎂的有機(jī)金屬化合物)或烷基硼酸鹽(通常是NaBEt4)進(jìn)行烷基化或使用硼氫化物(如硼氫化鈉NaBH4)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。NaBEt4由于其在水相基質(zhì)中的應(yīng)用以及具有在線和離線狀態(tài)下均能同時進(jìn)行衍生和提取的功能［34］，不需要分解多余的衍生試劑且生成物比較穩(wěn)定，是最被常用到的試劑。而Grignard試劑因其需要較為專業(yè)的處理技術(shù)和干燥條件來避免與水、酸、酮和醇發(fā)生反應(yīng)影響檢測結(jié)果，很少用于有機(jī)錫的衍生。NaBH4劇烈的氫化衍生反應(yīng)中會有氣泡產(chǎn)生，會帶走氫化后的OTs，重現(xiàn)性不理想，NaBEt4的衍生就較為簡單，在水相中就能把有機(jī)錫轉(zhuǎn)化為其乙基衍生物。然而衍生過程中必須調(diào)節(jié)pH(pH4～6)，使乙基可以親核取代有機(jī)錫陽離子。NaBH4可能會受到復(fù)雜的基質(zhì)(如生物和沉積物)的干擾，主要源自與金屬的反應(yīng)和金屬硼化物的生成(抑制生成Sn H鍵)［31］。通過比較目前國內(nèi)外的衍生方法優(yōu)劣，最終本研究選用NaBEt4作為衍生試劑。

表2 線性范圍、線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equation，correlation coefficient and detection limit

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按1.2實(shí)驗(yàn)方法所示對10、20、50、200、500、1000μg/L的OTs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后進(jìn)行GC－MS測定，將9種OTs的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，將對應(yīng)的定量離子積分峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，在10～1000μg/L范圍里9種OTs的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積呈線性，相關(guān)系數(shù)在0.9952～0.9988之間，檢出限(3S/N)為0.4～1.0μg/kg(干重dw，以Sn計)。依照3倍的信噪比得到9種OTs的檢出限，10倍信噪比計算定量限，詳見表2。經(jīng)GC－MS分析后總離子流色譜圖如圖2。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of a mixed standard solution

2.5 方法的精密度和回收試驗(yàn)

稱取1.00 g小黃魚樣品，同一樣品重復(fù)測定5次作為平行，結(jié)果如表3，同時對小黃魚樣品進(jìn)行低(2μg/kg)、中(20μg/kg)和高(200μg/kg)3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，同樣平行測定5次，結(jié)果如表3。樣品含量均以Sn計。

從表3得出，3種加標(biāo)濃度下加標(biāo)回收率為81.2%～115.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～7.5%之間，其中在2μg/kg低濃度加標(biāo)水平下回收率為96.4%～115.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～7.5%，在20μg/kg中濃度加標(biāo)水平下回收率為81.2%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～6.5%，在200μg/kg高濃度加標(biāo)水平下回收率為83.2%～100.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～6.2%。結(jié)果表明在3種不同的加標(biāo)濃度下樣品加標(biāo)均有較好的回收率，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也在較小的范圍內(nèi)，測定結(jié)果的精密度、準(zhǔn)確度都滿足要求。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 3 Precision and recovery test results(n=5)

表4 樣品分析結(jié)果(濕重，以Sn計，μg/kg)Table 4 Sample analysis results(wet weight，in terms of Sn，μg/kg)

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分別對市售的龍頭魚、梅童魚、小黃魚、大黃魚、帶魚、鯧魚、海鰻、哈氏仿對蝦、口蝦蛄、梭子蟹、縊蟶、牡蠣等海產(chǎn)品中OTs進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，梅童魚、小黃魚、大黃魚、海鰻中均未檢出9種OTs。在龍頭魚、帶魚、鯧魚、哈氏仿對蝦、口蝦蛄、梭子蟹、縊蟶、牡蠣中，除MOT、TeBT、DOT未檢出外，其余OTs均有被檢出，9種OTs總量為ND～162.0μg/kg(ww，以Sn計)。其中貝類中苯基錫(5.8～89.4μg/kg)的含量均高于丁基錫(ND～0.6μg/kg)、辛基錫(ND)，也高于除鯧魚(13.0～22.1μg/kg)外的所有魚類(ND～14.2μg/kg)和甲殼類(ND～3.3μg/kg)樣品，說明貝類較魚類和甲殼類更易富集苯基錫，也許是因?yàn)檐涹w動物攜有稍強(qiáng)的產(chǎn)生金屬結(jié)合蛋白的本領(lǐng)［35］。由此可見，舟山市沿海的海產(chǎn)品已存在有機(jī)錫污染現(xiàn)象，尤其是TPhT的污染最為嚴(yán)重，需引起消費(fèi)者注意。

3 結(jié)論

本文建立了超聲波萃取，冷凍脫脂，衍生前后分別進(jìn)行分散固相萃取凈化，氣相色譜質(zhì)譜法測定海產(chǎn)品的OTs的檢測方法。在優(yōu)化條件下，9種有機(jī)錫化合物的線性范圍為10～1000μg/L，檢出限(3S/N)為0.4～1.0μg/kg(dw，以Sn計)。在2.00、20.0和200μg/kg 3個添加水平的回收率為81.2%～115.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～7.5%(n=5)。該方法相比凝膠滲透色譜、固相萃取凈化等有機(jī)溶劑消耗量大，耗時較長等缺點(diǎn)，大大提高了檢測速度。另外，根據(jù)舟山市售海產(chǎn)品中OTs檢測結(jié)果，龍頭魚、帶魚、鯧魚、哈氏仿對蝦、口蝦蛄、梭子蟹、縊蟶、牡蠣中9種OTs總量為ND～162.0μg/kg(ww，以Sn計)，說明海產(chǎn)品已存在一定水平的有機(jī)錫污染，應(yīng)當(dāng)引發(fā)相關(guān)部門和消費(fèi)者的重視。下一步應(yīng)開發(fā)新型的萃取凈化的方法，使前處理過程更加簡便高效，同時根據(jù)有機(jī)錫化合物的特性開發(fā)更多分析技術(shù)用于檢測不同形態(tài)的有機(jī)錫化合物，從而提高對海產(chǎn)品中各類有機(jī)錫化合物的監(jiān)測水平，保障消費(fèi)者的食品安全需求。