發(fā)光桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的工藝優(yōu)化

陳立功，吳家葳，張 冉，張慶芳，遲乃玉，王曉輝，*

(1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116600;2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600)

幾丁質(zhì)(chitin)又稱甲殼質(zhì)、殼多糖，為天然生物聚合物，是海洋中含量最豐富的可再生資源，每年形成量超過1011噸［1－3］。海洋幾丁質(zhì)主要通過海洋低溫微生物分泌的低溫幾丁質(zhì)酶完成降解，參與海洋物質(zhì)循環(huán)［4］。幾丁質(zhì)廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，在蝦蟹殼中的含量極高，主要起支撐和保護(hù)作用［5－7］。幾丁質(zhì)水解后生成的幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物，具有良好的組織兼容性及免疫抗菌作用，具有重要應(yīng)用價(jià)值［8－10］。粉狀晶體幾丁質(zhì)為白色或淡黃色固體，性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水，自然狀態(tài)下不易降解。每年有超過8萬噸幾丁質(zhì)被視為廢物丟棄，既污染了環(huán)境，又造成了資源浪費(fèi)［11－13］。

幾丁質(zhì)酶(chitinase，EC 3.2.1.14)是專一降解幾丁質(zhì)的一類糖苷水解酶的總稱，能夠完成幾丁質(zhì)到幾丁寡糖及幾丁單糖的轉(zhuǎn)化［14－15］。幾丁質(zhì)酶通過對(duì)幾丁質(zhì)的降解作用，可對(duì)病原真菌及昆蟲的生長(zhǎng)造成有效的抑制和殺傷［16－18］。目前對(duì)幾丁質(zhì)酶的研究，大多集中在微生物來源的幾丁質(zhì)酶上，包括假單胞菌、鏈霉菌和芽孢桿菌等［19－20］。已研究的幾丁質(zhì)酶主要集中于中高溫幾丁質(zhì)酶，隨著幾丁質(zhì)酶在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)中高溫幾丁質(zhì)酶雖然高溫下降解效率較高，但穩(wěn)定性差，且高溫的降解條件對(duì)設(shè)備要求較高，增加了生產(chǎn)成本，已經(jīng)不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要［21－22］。低溫酶在較低溫度下有較高的降解效率且穩(wěn)定性高，發(fā)現(xiàn)、發(fā)掘、開發(fā)低溫幾丁質(zhì)酶日漸成為研究熱點(diǎn)［23］。目前低溫幾丁質(zhì)酶的主要來源為低溫微生物(cold－adapted microorganism)，根據(jù)其生長(zhǎng)繁殖溫度可分為嗜冷菌(psychrophile)和耐冷菌(psychrotroph)，0℃是否能生長(zhǎng)繁殖，最適生長(zhǎng)溫度是否低于15℃是二者劃分的主要依據(jù)，嗜冷菌比耐冷菌更耐寒［24］。

海洋中有豐富的微生物資源未被開發(fā)利用，其天然的低溫環(huán)境和平均含鹽量3.5%的高鹽環(huán)境，是低溫微生物的天堂，其內(nèi)生活的微生物大多具有嗜冷或耐冷特性，并對(duì)高鹽環(huán)境具有一定的耐受性［15－26］。海洋微生物所產(chǎn)生的酶，往往在低溫下仍具有較高催化效率［27］。為滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，解決幾丁質(zhì)酶在低溫下降解效率不高的問題，越來越多的學(xué)者聚焦于海洋，期待從海洋篩選到高產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的菌株，且已發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas sp.BK1)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.TAD20)等多種可產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的微生物，但酶活力均較低［28－30］。目前，國(guó)內(nèi)外研究中未見發(fā)光桿菌屬菌株產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道。

本文從海泥中篩選到高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的發(fā)光桿菌，命名為Photobacterium sp.LG－1，前期對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定及單因素發(fā)酵條件優(yōu)化，單因素優(yōu)化后菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活為4.57 U/mL［31］。為了滿足幾丁質(zhì)酶工業(yè)應(yīng)用的大量需求，提高幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量，本研究利用Plackett－Burman、Box－Behnken實(shí)驗(yàn)對(duì)LG－1產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，提高幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量及活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)光桿菌(Photobacterium sp.LG－1)篩選自中國(guó)遼寧大連渤海海域近海底泥5～100 m(123°391＇E，39°6972＇N);發(fā)酵培養(yǎng)基 膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L、酵母膏6.0 g/L，原地海水，自然p H;幾丁質(zhì) 博奧拓達(dá)(北京)公司;酵母膏 奧博星(北京)生物公司;瓊脂粉 北京索萊寶生物科技有限公司。

LTI－700低溫恒溫培養(yǎng)箱 上海愛朗儀器有限公司;CRY－2112恒溫?fù)u床 上海茸研儀器有限公司;Thermo Multiskan1510酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)制備 根據(jù)王曉輝等［16］的方法進(jìn)行1%膠體幾丁質(zhì)的制備:取10 g幾丁質(zhì)置于研缽，緩慢加入100 mL濃鹽酸并不斷攪拌1 h，保鮮膜封口后于冰箱4℃下過夜。大量超純水反復(fù)洗至中性，離心后用0.1 moL/L磷酸緩沖液定容為1 L。

1.2.2 酶活測(cè)定 取0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)與0.5 mL粗酶液混合，25℃下水浴保溫15 min，10000 r/min離心5 min，取上清200μL煮沸5 min，冷卻后，加入200μL DNS溶液煮沸5 min，冷卻后加入600μL超純水，10000 r/min離心10 min，取200μL于96空板中測(cè)定OD520，三組平行實(shí)驗(yàn)。酶活單位定義(U):在上述條件下，催化產(chǎn)生lμmol N－乙酰－D－氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.3 菌懸液的制備及產(chǎn)酶發(fā)酵工藝 挑取單菌落至5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，15℃220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD6000.5～0.6，作為發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)種子液。種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h，將發(fā)酵液6000 r/min離心去沉淀，得粗酶液，測(cè)定酶活性。

1.2.4 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn) 為確定影響菌株LG－1幾丁質(zhì)酶活的三個(gè)主要因素，根據(jù)前期單因素優(yōu)化結(jié)果:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L、酵母膏6.0 g/L、發(fā)酵溫度15℃、初始p H7.0、轉(zhuǎn)速為220 r/min、裝液量75 mL/250 mL、接種量1%、發(fā)酵時(shí)間96 h，以軟件Minitab 15對(duì)膠體幾丁質(zhì)濃度、酵母膏濃度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、裝液量、接種量(種子液菌體濃度OD6000.5～0.6)、初始p H、發(fā)酵時(shí)間8個(gè)因素設(shè)計(jì)N=12的8因素2水平Placket－Burman實(shí)驗(yàn)。3組平行試驗(yàn)。各因素對(duì)應(yīng)因子代碼如表1所示。

表1 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平及分析Table 1 Levels of the variables and statistical analysis of Plackett－Burman design

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 以三個(gè)影響酶活的主要因素設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍?組平行試驗(yàn)。

1.2.6 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以軟件Minitab 15設(shè)計(jì)N=17的3因素3水平的Box－Behnken實(shí)驗(yàn)，自變量為發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時(shí)間X2、酵母膏X3。3組平行試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如表2所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Minitab 15軟件通過響應(yīng)面分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，得到最優(yōu)結(jié)果后，運(yùn)用Minitab 15軟件對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的Plackett－Burman設(shè)計(jì)

根據(jù)表1影響酶活的各因素及水平，利用Minitab 15軟件設(shè)計(jì)N=12的P－B實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵后離心發(fā)酵液，取上清進(jìn)行酶活檢測(cè)。3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

表3 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and result of Plackett－Burman influencing

P－B實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示，P值＜0.05的因素有膠體幾丁質(zhì)、酵母膏、發(fā)酵溫度、裝液量、接種量及發(fā)酵時(shí)間，以上因素對(duì)菌株LG－1產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性的影響均＞95%，達(dá)到顯著水平。其它影響因素選值為單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果。其中發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和酵母膏添加量三個(gè)因素影響效果最為顯著。因此以這三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表4 P－B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素主效應(yīng)分析結(jié)果Table 4 Results of the variables and effect in P－B design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定中心點(diǎn)結(jié)果(表5)可知，3組平行實(shí)驗(yàn)得到最佳因子組為第2組。最佳因子組條件為:發(fā)酵溫度(X1)15℃，發(fā)酵時(shí)間(X2)96 h，酵母膏添加量(X3)6 g/L。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and result of steepest ascent

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.3.1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以X1(發(fā)酵溫度)、X2(發(fā)酵時(shí)間)、X3(酵母膏)為自變量設(shè)計(jì)N=17的3因素3水平的Box－Behnken實(shí)驗(yàn)。3組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 Box－Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box－Behnken design

2.3.2 回歸方程的建立及其顯著性 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Minitab 15軟件進(jìn)行分析確定影響菌株LG－1產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶活性的二次回歸方程:Y=4.19+0.46X1+0.11X2+0.10X3+0.45X1X2－0.44X1X3

該方程進(jìn)行回歸系數(shù)顯著性檢測(cè)和方差分析結(jié)果(見表7)顯示，該回歸模型的P值＜0.01，而失擬項(xiàng)的P值＞0.05，證明模型建立成功。其自變量X2，X3對(duì)響應(yīng)值的影響顯著(P＜0.05)，自變量X1、對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(P＜影響不顯著(P＞0.05)?；貧w系數(shù)R2=98.85%大于90%，校正決定系數(shù)表明模型相關(guān)度很好。此模型可用來分析和預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件確定 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型利用Minitab 15軟件繪出響應(yīng)面分析圖(圖1～圖3)。由響應(yīng)面圖可以看出:發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時(shí)間X2、酵母膏X3三個(gè)因素兩兩之間存在交互作用。當(dāng)發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時(shí)間X2、酵母膏X3分別為20℃，120 h，4.42 g/L時(shí)達(dá)到最佳，幾丁質(zhì)酶活的理論值為5.10 U/mL。

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of the quadratic model

圖1 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活的交互影響Fig.1 Response surface plot of the effects of fermentation temperature and fermentation time on the enzyme activity

圖2 發(fā)酵溫度與酵母膏對(duì)酶活的交互影響Fig.2 Response surface plot of the effects of fermentation temperature andyeast extract on the enzyme activity

在考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)上，對(duì)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，將軟件分析得出的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)整:膠體幾丁質(zhì)濃度12.0 g/L、酵母膏濃度4.5 g/L、發(fā)酵溫度20℃、初始p H7.0、轉(zhuǎn)速為220 r/min、裝液量75 mL/250 mL、接種量1%、發(fā)酵時(shí)間120 h，3次平行實(shí)驗(yàn)所得幾丁質(zhì)酶的平均酶活為5.10 U/mL，與理論值相同，表明響應(yīng)面法所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。與優(yōu)化前酶活4.57 U/mL相比，響應(yīng)面優(yōu)化后的酶活提高了11.50%。

圖3 發(fā)酵時(shí)間與酵母膏對(duì)酶活的交互影響Fig.3 Response surface plot of the effects of fermentation timeandyeast extract on the enzyme activity

3 結(jié)論與討論

根據(jù)嗜冷菌和耐冷菌的劃分依據(jù)［24］，發(fā)光桿菌Photobacterium sp.LG－1最適生長(zhǎng)產(chǎn)酶溫度為20℃，高于15℃，初步判斷菌株LG－1為耐冷菌。本研究在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)菌株LG－1的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，完成了發(fā)酵產(chǎn)酶條件的系統(tǒng)性優(yōu)化過程。確定了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和酵母膏是影響菌株P(guān)hotobacterium sp.LG－1產(chǎn)酶的重要因素。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)聯(lián)合優(yōu)化，確定了三個(gè)最顯著影響因素的最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度20℃、發(fā)酵時(shí)間120 h和酵母膏濃度4.42 g/L。根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整后的菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶最佳條件為:膠體幾丁質(zhì)濃度12.0 g/L、酵母膏濃度4.5 g/L、發(fā)酵溫度20℃、初始p H7.0、轉(zhuǎn)速為220 r/min、裝液量75 mL/250 mL、接種量1%、發(fā)酵時(shí)間120 h。此最優(yōu)發(fā)酵條件下，菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力達(dá)5.10 U/mL，較優(yōu)化前酶活4.57 U/mL提高了11.50%。本研究為菌株LG－1發(fā)酵產(chǎn)酶提供了更好的條件，利于實(shí)驗(yàn)中高產(chǎn)量、高活性幾丁質(zhì)酶的獲取，為低溫幾丁質(zhì)酶的降解機(jī)制研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了有力支撐。