電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定阿莫西林原料藥中的7種雜質(zhì)元素

張春華，陳亮，陳春桃，韓必愷，李子宜，吳惠勤，黃曉蘭

［廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣州 510070］

隨著人們對(duì)藥品安全性、質(zhì)量控制的更為嚴(yán)格的要求，人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）發(fā)布了《元素雜質(zhì)指南Q3D》（ICHQ3D），規(guī)定了口服、注射和吸入制劑中的24種元素雜質(zhì)的日允許暴露量（PDE）［1–2］；此外，美國(guó)藥典USP41＜232＞提出相應(yīng)的要求，其規(guī)定的元素種類和限量與ICHQ3D一致［3］?；瘜W(xué)藥品中無(wú)機(jī)雜質(zhì)元素對(duì)疾病的治療沒(méi)有益處，反而會(huì)對(duì)病人的健康帶來(lái)?yè)p害，這就需要我們關(guān)注化學(xué)藥品中的無(wú)機(jī)元素雜質(zhì)。阿莫西林為廣譜青霉素類抗生素，是繼氨芐西林后市場(chǎng)上第二個(gè)氨基青霉素類抗菌藥物，也是最常見(jiàn)的抗菌藥物之一，其原料藥可以被制成多種劑型的制劑，如國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)上市的有片、腸溶片、膠囊、干混懸劑、顆粒劑等劑型，其中以阿莫西林膠囊為主［4–5］。為了加強(qiáng)阿莫西林原料藥中元素雜質(zhì)的質(zhì)量控制，需要建立相應(yīng)的雜質(zhì)元素檢測(cè)方法，特別是第1類和第2A類的砷（As）、鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）、釩（V）、鈷（Co）、鎳（Ni）7種雜質(zhì)元素含量的檢測(cè)方法。

目前，元素雜質(zhì)的測(cè)定方法主要有原子吸收光譜（AAS）法［6–7］、原子熒光（AFS）法［8–9］、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP–OES）法［10–11］和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP–MS）法［12–16］。其中，AAS法和AFS法每次只能測(cè)試1個(gè)或是幾個(gè)元素，效率較低；ICP–OES法能多元素同時(shí)測(cè)定，但是檢出限較高；ICP–MS法具有靈敏度高、能夠多元素同時(shí)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于痕量、微量元素的測(cè)定，也是USP41＜233＞推薦的方法之一［17］。樣品前處理方法有微波消解、濕法消解、直接溶解等，微波消解和濕法消解需要消耗較多的試劑，而直接溶解法前處理簡(jiǎn)單、快捷，試劑消耗小，能在較短的時(shí)間內(nèi)完成樣品的測(cè)試。

阿莫西林原料藥和制劑中7種雜質(zhì)元素的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道，筆者以阿莫西林原料藥為研究對(duì)象，建立了用2%硝酸直接溶解稀釋樣品，ICP–MS測(cè)定阿莫西林原料藥中V、Co、Ni、As、Cd、Pb、Hg 7種雜質(zhì)元素含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：Agilent 7700x型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：NBL 214e型，感量為0.1 mg，艾德姆衡器（武漢）有限公司。

多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（含V、Co、Ni、As、Cd、Pb等24種元素）：100 μg／mL，編號(hào)為GSB 04–1767–2004，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

鍺 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液：1 000 μg／mL，編 號(hào) 為GSB 04–1728–2004，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

汞標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg／mL，編號(hào)為GSB G 62069–90，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心。

錸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg／mL，編號(hào)為GSB G 62064–90，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心。

銦標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg／mL，編號(hào)為GSB 04–1731–2004，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心。

ICP–MS調(diào)諧溶液：Ce、Co、Li、Tl、Y質(zhì)量濃度均為10 μg／mL，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

濃硝酸：UP級(jí)，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm），實(shí)驗(yàn)室自制。

阿莫西林原料藥（3批），由某制藥企業(yè)提供。

1.2 ICP–MS儀器條件

射頻功率：1.55 kW；等離子體氣：氬氣，流量為15.0 L／min；輔助氣：氬氣，流量為0.8 L／min；載氣：氬氣，流量為0.8 L／min；稀釋氣：氬氣，流量為0.35 L／min；碰撞氣：氦氣，流量為4.3 mL／min；采樣深度：10 mm；霧化室溫度：2 ℃；內(nèi)標(biāo)元素通過(guò)T型三通管在線引入；監(jiān)測(cè)同位素：51V、59Co、60Ni、75As、111Cd、208Pb、202Hg、72Ge、115In、185Re。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品處理

在50 mL的比色管中，加入阿莫西林原料藥0.25 g，用2%硝酸溶解，并定容至50 mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

V、Co、Ni、As、Cd、Pb系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1：取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液逐級(jí)稀釋，各元素的質(zhì)量濃度均分別為0、0.5、1、5、10、50、100、200 μg／L。

Hg系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液2：取汞標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液逐級(jí)稀釋，Hg的質(zhì)量濃度為0、0.5、1、2、5、10 μg／L（臨用現(xiàn)配）。

Ge、In、Re混合內(nèi)標(biāo)溶液：取Ge、In、Re標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸稀釋成各元素質(zhì)量濃度均為0.5 mg／L的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.3 定量分析方法

ICP–MS儀器點(diǎn)火穩(wěn)定后，采用ICP–MS調(diào)諧溶液保證狀態(tài)滿足使用要求，依次分析標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液、樣品溶液。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品溶液中的元素進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器工作條件的選擇

儀器配有八極桿碰撞–反應(yīng)池，比較了采用He作為碰撞氣體（He模式）和不采用碰撞氣體（NO Gas模式）2種工作模式，發(fā)現(xiàn)采用He模式能夠明顯的去除多原子離子對(duì)待測(cè)元素的干擾，如35Cl16O+對(duì)51V+、35Cl40Ar+對(duì)75As+的干擾，所以采用He模式，優(yōu)化后的He流量為4.3 mL／min。

采用了直接稀酸溶解制備樣品溶液的前處理方法，樣品溶液中有機(jī)物含量為0.5%，為了減少在等離子體接口的采樣錐處產(chǎn)生積碳，開(kāi)啟并優(yōu)化了在線稀釋氣體的流量，最終優(yōu)化后稀釋氣體流量為0.35 L／min。

2.2 樣品處理方法的選擇

ICP–MS測(cè)定元素雜質(zhì)時(shí)，根據(jù)樣品的性質(zhì)，可采用直接進(jìn)樣分析、溶劑溶解分析和消解后分析［16］。采用2%硝酸作為溶劑溶解和采用濃硝酸微波消解均能將阿莫西林樣品處理為無(wú)色透明的溶液，但是前者的操作更簡(jiǎn)便，硝酸的使用量少，酸及其處理過(guò)程帶來(lái)的空白污染問(wèn)題少，所以采用2%硝酸作為溶劑溶解樣品的方法來(lái)制備樣品溶液。

2.3 樣品處理方法的優(yōu)化

比較了取樣量分別為1、0.5、0.25 g，定容體積為50 mL時(shí)，不同取樣量對(duì)內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的影響。當(dāng)取樣質(zhì)量為1 g時(shí)，Ge、In、Re三個(gè)內(nèi)標(biāo)元素的回收率均為150%，取樣質(zhì)量為0.5 g和0.25 g時(shí)，內(nèi)標(biāo)回收率在100%～120%之間，表明溶液中阿莫西林含量高時(shí)，內(nèi)標(biāo)元素的響應(yīng)增強(qiáng)了，取樣質(zhì)量為0.5 g或0.25 g較合適。

在上述3種取樣量的條件下，配制了最終溶液質(zhì)量濃度為10 μg／L的V、Co、Ni、As、Cd、Pb和Hg的加標(biāo)溶液，結(jié)果表明取樣質(zhì)量分別為1、0.5、0.25 g時(shí)，As的回收率分別約為260%、160%、130%，其它元素回收率在80%～120%之間。不同取樣質(zhì)量，主要是對(duì)As的測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響，這是因?yàn)锳s的電離能較高，樣品中的有機(jī)成分增加了其在等離子體中的電離。

綜上，選擇樣品處理方法的取樣質(zhì)量為0.25 g，定容體積為50 mL。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性方程、線性范圍與檢出限

按1.2儀器工作條件測(cè)定1.3.2配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各元素的每秒計(jì)數(shù)（CPS）與內(nèi)標(biāo)元素CPS的比值（y）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x，μg／L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸計(jì)算得7種元素的線性方程。7種元素的線性方程，線性范圍和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。各元素相關(guān)系數(shù)為0.999 7～1.000 0，說(shuō)明線性關(guān)系良好。

表1 方法的線性關(guān)系

以11次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)空白溶液得到各元素的CPS，計(jì)算11次CPS的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），以3SD對(duì)應(yīng)樣品中待測(cè)元素含量為方法的檢出限（LOD），計(jì)算得V、Co、Ni、As、Cd、Pb、Hg方法檢出限分別為0.001 0、0.001 5、0.006 0、0.005 4、0.004 0、0.002 4、0.005 2 mg／kg。

定量限濃度要滿足準(zhǔn)確度的要求，意味著必須對(duì)定量限濃度進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)驗(yàn)證。定量限濃度設(shè)置為線性最低點(diǎn)，7種元素的定量限均為0.1 mg／kg，經(jīng)加標(biāo)回收試驗(yàn)驗(yàn)證，能滿足準(zhǔn)確度的要求。

2.4.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用加標(biāo)溶液的回收率來(lái)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。精密稱取12份阿莫西林樣品，分為3組，分別作為低、中、高濃度的加標(biāo)樣品，平行樣品數(shù)分別為3、6、3份，加入適量多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其最終溶液中各元素質(zhì)量濃度均分別為0.5、5、50 μg／L；另取12份樣品，加入適量Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其最終溶液中元素質(zhì)量濃度分別為0.5、2、5 μg／L；按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

由表2可知，在3個(gè)濃度加標(biāo)水平下，7種元素的平均回收率為86.1%～130.9%，均在70%～150%之間，滿足準(zhǔn)確度要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)由加標(biāo)回收試驗(yàn)中間濃度的6次平行測(cè)定結(jié)果來(lái)評(píng)估，以各元素實(shí)際測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，V、Co、Ni、As、Cd、Pb、Hg測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%、1.6%、2.0%、2.6%、2.5%、1.5%、4.5%，均 小 于20%［17］，滿足方法重復(fù)性要求。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 中間精密度試驗(yàn)

中間精密度由準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)中所使用的中間濃度加標(biāo)溶液來(lái)評(píng)估，由2名分析人員在不同的時(shí)間各自獨(dú)立測(cè)試6份加標(biāo)樣品，以12份樣品中各元素實(shí)際測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。V、Co、Ni、As、Cd、Pb、Hg測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.2%、1.3%、3.2%、4.6%、5.7%、4.9%、6.3%，均 小 于25%［17］，滿足中間精密度要求。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

按上述建立的方法，測(cè)定了3批阿莫西林樣品中的7種元素雜質(zhì)，結(jié)果表明，各批次阿莫西林樣品中7種元素雜質(zhì)的含量均低于定量限，說(shuō)明其安全風(fēng)險(xiǎn)較小。

3 結(jié)論

（1）建立了ICP–MS方法測(cè)定阿莫西林原料藥中V、Co、Ni、As、Cd、Hg和Pb 7種雜質(zhì)元素含量的方法。方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法準(zhǔn)確度與精密度良好。

（2）采用2%硝酸溶解樣品的樣品前處理方法，與微波消解等消解方法相比，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、快速，能夠節(jié)省試劑使用量、同時(shí)也減少樣品消解過(guò)程帶來(lái)的本底、試劑污染。

（3）該方法可為阿莫西林原料藥中7種雜質(zhì)元素的質(zhì)量控制、原料藥中元素雜質(zhì)分析方法的建立與評(píng)價(jià)提供參考。

（4）樣品處理方法的優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，溶液中的有機(jī)成分會(huì)增加As元素在等離子體中的電離，導(dǎo)致回收率變大，在原料藥元素雜質(zhì)分析方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)該優(yōu)化出合適的取樣量。