基于網絡藥理學探究1-脫氧野尻霉素治療2 型糖尿病作用機制

李俊峰 吳力超 王 進 孫騰飛 趙俊慧 張婷婷 劉文洪

糖尿病是一組因胰島素絕對或相對分泌不足和（或）胰島素利用障礙引起的碳水化合物、蛋白質、脂肪代謝紊亂性疾病。根據國際糖尿病聯合會2019 年最新報告，到2045 年，糖尿病患者將從2019 年的4.63 億增加到7 億，其中，90%左右為2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]。目前T2DM 的常規(guī)口服治療藥物有磺脲類、格列奈類、雙胍類、噻唑烷二酮類、α-葡萄糖苷酶抑制劑類，但可能出現低血糖、胃腸道反應等不良反應。

中藥及其提取物在內的天然活性產物，以其資源豐富、作用溫和、毒副作用小而被用于治療T2DM，逐漸成為研究熱點[2]。桑葉具有良好的降血糖、降血脂等作用，廣泛用于治療糖尿病、肥胖癥等疾病[3]。1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是桑葉中的主要生物堿（含量為0.3%），被認為是關鍵的生物活性物質。Li 等[4]建立糖尿病小鼠模型，發(fā)現經DNJ 治療后小鼠空腹血糖水平、胰島素敏感性都得到顯著改善，同時DNJ 加速肝葡萄糖代謝。體外實驗研究發(fā)現，桑葉中DNJ 可以促進成熟3T3-L1 細胞對葡萄糖的吸收來調節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[5]。目前已經證實DNJ 是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，對糖尿病顯示出良好的生物活性，但大部分學者集中在探討其對血糖、血脂、相關酶活的比較，而具體作用機制尚未深入[6]。本研究擬借助網絡藥理學方法，研究藥物、靶點、通路之間的網絡關系，旨在為闡明DNJ 治療T2DM 的作用機制提供理論參考。

1 資料與方法

1.1數據庫 PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 網 站（http://www.swisstargetprediction.ch/）；Genecard 數據庫（https://www.genecards.org/）；OMIM 數據庫（https://omim.org/）；Draw Venn Diagram 網站（http://bioin formatics.psb.ugent.be/Webtools/venn/）；STRING11.0 數據庫（https://string-db.org/）；Metascape 數據庫（http://metascape.org）。

1.2DNJ 潛在靶點獲取 利用DNJ 的CAS 號（19130-96-2）從PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得DNJ 的SDF 文件，將SDF 文件導入SwissTargetPrediction 網站[7]（http://www.swiss targetprediction.ch/），設置屬性為“Homo sapiens”，進行靶點預測，獲取DNJ 的潛在靶點。

1.3T2DM 相關靶點收集 以“2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）”為關鍵詞輸入到Genecard數據庫[8]（https://www.genecards.org/）和OMIM 數據庫[9]（Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/）檢索獲得T2DM 治療靶點。

1.4藥物與疾病共同靶點篩選及互作網絡構建 使用Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/venn/）對T2DM 治療靶點和DNJ 潛在靶點進行分析，獲取藥物與疾病的共同靶點，繪制韋恩圖（Venn），這些共同靶點代表DNJ 治療T2DM 的潛在作用靶點。利用STRING11.0 數據庫[10]（https://string-db.org/）構建共同靶點蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI） 網絡，將生物種類設定為“Homo sapiens”，其余均為默認設置。用Cytoscape 3.7.2軟件可視化藥物與疾病共同靶點的PPI 網絡。

1.5核心靶點分析 使用Cytoscape 3.7.2 軟件的插件Cytohubba 和MCODE 挖掘DNJ 作用于T2DM 的PPI 網絡核心靶點[11]。Cytohubba 是Cytoscape 軟件中尋找核心靶點的一個插件，用于發(fā)現復雜網絡中的關鍵目標[12]。利用Draw Venn Diagram（http://bioinfor matics.psb.ugent.be/Webtools/venn/） 對Cytohubba 得出的結果進行分析，得到的重疊靶點即為核心靶點。Molecular Complex Detection（MCODE）可以將基因網絡中的關鍵靶點模塊提取出來，發(fā)現PPI 網絡中相互作用的密集區(qū)域，即各聚集的模塊，默認選擇得分前二的模塊作為分析對象，從而找出核心靶點[13]。Cytohubba 和MCODE 的參數均為默認設置。

1.6GO 和KEGG 富集分析 利用Metascape 數據庫[14]（http://metascape.org）將獲取的DNJ 治療T2DM的所有潛在靶點進行生物信息學在線分析，包括基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以P＜0.01 為標準，篩選出顯著性GO 富集項目及靶點參與的關鍵通路信息。應用R 語言軟件對以上分析結果可視化。同時將藥物、靶點、通路信息導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建DNJ 治療T2DM 的“藥物-靶點-通路”網絡。

2 結果

2.1DNJ 和T2DM 潛在靶點獲取 利用SwissTargetPrediction 網站對DNJ 進行靶點預測，共獲得100個潛在靶點（見圖1A）。通過Genecard 數據庫與OMIM 數據庫檢索，去除重復值，共獲得T2DM 疾病相關靶點5381 個（見圖1B）。

圖1 潛在靶點獲取

2.2共同靶點PPI 網絡構建 繪制Venn 圖，結果表明，通過匹配100 個藥物靶點和5381 個疾病靶點，篩選出72 個共同靶點（見圖2A），即DNJ 治療T2DM 的潛在靶點?；赟TRING11.0 數據庫得到共同靶點的PPI 網絡，互作網絡中有71 個節(jié)點（剔除一個游離節(jié)點）和245 條邊，節(jié)點代表DNJ 與T2DM的共同靶點，邊代表靶點間的互作關系。其中，節(jié)點越大，顏色越深，該節(jié)點與其他節(jié)點的連接數量越多，表示該節(jié)點在整個網絡中的貢獻度（degree）越大，即該靶點與其他靶點互作頻次高，說明藥物與其有較高的結合活性，PPI 網絡圖中重要靶點包括PTGS2、MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2等（見圖2B）。

圖2 DNJ 與T2DM 共同靶點PPI 網絡圖

2.3核心靶點分析結果 Cytohubba 分析獲得MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 共7個核心靶點（見圖3A）。MCODE 分析獲得了得分最高的兩個模塊，得分分別為7.067 和4.000。模塊1 和模塊2 包含了從Cytohubba 分析中獲得的7 個核心靶點，這進一步證實MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 的重要性（見圖3B）。

圖3 CytoHubba 和MCODE 分析核心靶點

2.4GO 富集分析結果 通過Metascape 數據庫對DNJ 治療T2DM 的潛在靶點進行GO 分析，富集結果顯示，具有生物學過程406 條，分子功能99 條，細胞成分72 條，根據P 值大小各篩選出前10 條展示（見圖4）。由圖可知，涉及到的主要生物學過程（molecular function）包括化學突觸傳遞（chemical synaptic transmission）、順行突觸信號（anterograde transsynaptic signaling）、碳水化合物代謝過程（carbohydrate metabolic process），參與的分子功能（molecular function）主要包括水解O-糖基化合物酶活性（hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、碳水化合物結合（carbohydrate binding）、葡萄糖苷酶活性（glucosidase activity）等，主要細胞成分（cellular component）有突觸（presynapse）、突觸膜（synaptic membrane）、軸突（axon）等。

圖4 DNJ 治療T2DM 靶點的GO 富集分析結果（前10 條）

2.5KEGG 富集分析結果 KEGG 通路分析結果表明，DNJ 治療T2DM 主要集中在46 條信號通路中（P＜0.01）。根據P 值大小篩選出前10 條KEGG 通路，利用R 語言軟件繪制氣泡圖（見圖5）。由圖可知，72 個靶點主要富集在神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、cAMP 信號通路（cAMP signaling pathway）、半乳糖代謝（galactose metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）等，表明DNJ 可通過多條通路的協調作用發(fā)揮治療T2DM 作用。

圖5 KEGG 通路分析氣泡圖

利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建藥物-靶點-通路網絡（見圖6），發(fā)現核心靶點MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 富集在重要通路包括神經活性配體-受體相互作用、cAMP 信號通路、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、其他聚糖降解等。

圖6 藥物-靶點-通路網絡圖

3 討論

為探討DNJ 治療T2DM 的可能作用機制，本研究利用SwissTargetPrediction 網站、Genecard 數據庫、OMIM 數據庫獲得DNJ 治療T2DM 的潛在作用靶點72 個，Cytoscape 3.7.2 軟件對作用靶點的PPI 網絡圖可視化分析，發(fā)現重要靶點包括PTGS2、MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA、DRD2 等；使用Cytoscape 3.7.2 軟件的Cytohubba 和MCODE 插件挖掘DNJ 作用于T2DM 的PPI 網絡的核心靶點，共篩選出7 個核心靶點，包括MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2，與PPI 網絡可視化分析結果一致。其中，MGAM 是一種α-葡萄糖苷酶消化酶，它通過在非還原端水解線性α（1→4）葡萄糖低聚物或糊精來催化淀粉消化的關鍵末端反應，并在血液中釋放葡萄糖[15]。MGAM 在調節(jié)餐中葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用[16]。CNR1 與肥胖癥和血脂異常有關[17]，并且已有研究發(fā)現CNR1 活性的調節(jié)在糖尿病及其并發(fā)癥中起重要作用[18]。GLA（α-galacto-sidase）和GLB（β-galactosidase）在糖尿病動物腎臟中的濃度較低，這可能是高血糖癥的結果[19]。另有研究報道，miR-26a 和miR-26b 通過下調SI 的表達來達到糖尿病治療的目的[20]。β-D-mannosidase（MANBA）與糖尿病相關，并且糖尿病患者血清中MANBA 活性顯著降低[21]。DRD2 等位基因在T2DM 患者中似乎非常普遍，對飲食、體重和血糖控制的潛在影響值得進一步探討[22]。以上結果表明，MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 可能是DNJ 治療T2DM的潛在作用靶點。

最后通過GO 和KEGG 富集分析，發(fā)現DNJ 治療T2DM 主要涉及化學突觸傳遞、順行突觸信號、碳水化合物代謝過程等生物學過程，通過調節(jié)神經活性配體-受體相互作用、cAMP 信號通路、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等發(fā)揮T2DM 治療作用，并且通路中關鍵靶點涉及MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2，結果與篩選的核心靶點亦相同。由此預測DNJ 主要通過作用上述生物過程及信號通路來治療T2DM。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的方法，預測DNJ 治療T2DM 的分子機制具有多靶點、多通路的特點，為后續(xù)實驗驗證提供研究思路，同時從機制上為T2DM 的防治提供新思路和新方法。