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    桃葉珊瑚苷對人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及SCAP/SREBP-1 通路的影響

    2021-06-22 09:51:06馮淑炯江巧麗
    關(guān)鍵詞:桃葉氟尿嘧啶珊瑚

    馮淑炯 江巧麗

    脂質(zhì)代謝的重新編程是公認(rèn)的惡性腫瘤標(biāo)志,升高的脂質(zhì)合成是癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的最重要改變之一[1]。據(jù)報道,脂肪酸合酶表達(dá)升高可誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)展為S 期,刺激癌細(xì)胞增殖,在這些過程中,固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[2]。SREBPs 是一種轉(zhuǎn)錄因子家族,由SREBP-1a、SREBP-1c 和SREBP-2 組成。SREBP-1a 和SREBP-1c 這兩種SREBP-1 亞型在高爾基體中加工生成成熟的SREBP-1 蛋白,主要調(diào)節(jié)所需基因的表達(dá),用于脂肪酸合成,SREBP-2 負(fù)責(zé)膽固醇的合成[3]。研究顯示,SREBP-1 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中高度存在,其活性N 端高度定位在腫瘤細(xì)胞核中[4]。SREBPs 的活性受到伴游蛋白、SREBP 裂解激活蛋白(SCAP)和胰島素誘導(dǎo)基因(Insig)的精確控制。研究顯示,桃葉珊瑚苷對創(chuàng)傷性腦損傷和抗骨質(zhì)疏松有潛在藥理作用[5]。此外,桃葉珊瑚苷對腦血管疾病也有一定功效[6]。本研究擬探討桃葉珊瑚苷對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及SCAP/SREBP-1 通路的影響,報道如下。

    1 材料與方法

    1.1細(xì)胞及藥物 人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫,批號J501307);桃葉珊瑚苷(原料藥,純度98%,長沙上禾生物科技有限公司,批號AS-9653);5-氟尿嘧啶(原料藥,純度99%,武漢宏信康精細(xì)化工有限公司,批號51-21-8)。

    1.2主要試劑及儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(上海微科生物技術(shù)有限公司,批號P875-N10、P607-10);胎牛血清、青霉素、鏈霉素(上海素爾生物科技有限公司,批號XC45632、XC41565、XC25954);四唑鹽(MTT)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司,批號AS-0057L);二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma-Aldrich 公司,批號87463);基質(zhì)膠(Matrigel)、PBS 緩沖液(美國BD Biosciences 公司,批號ZA-231236、ZA-11095);膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶雙重染色試劑盒(上海陽光生物科技有限公司,批號CS4156);Trizol 試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司,批號AQ132-21);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)(日本Takara 公司,批號SX487、SX6079);放射免疫沉淀液、二辛可寧酸(BCA)蛋白測定試劑盒、聚偏二氟乙烯膜、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,批號EW-48-63、EW-51-27、EW-5011、EW-6613);鼠抗人SCAP、SREBP-1、GAPDH 單克隆抗體、鼠抗人二抗(美國Cell Signaling Technology Inc 公司,批號TS-65631、JT-58596、JT-58596、JT-0017);酶標(biāo)儀(深圳市投腦智富科技有限公司,型號:RT-6000);Transwell 腔室系統(tǒng)(北京佰樂良成科技有限公司,型號:CULTEX LTC);顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號:IX71);流式細(xì)胞儀(美國BD 公司,型號:FACSCaliburTM);實(shí)時熒光定量PCR 儀(美國伯樂公司,型號:9600);凝膠成像儀(北京廣開源商貿(mào)有限公司,型號:IAS-500)。

    1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞在RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng),該培養(yǎng)基補(bǔ)充了10%的胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為:37℃、5%CO2、2%O2、93%N2,進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分組設(shè)計:結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組:細(xì)胞濃度為5×106個/mL 的人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞液在10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng);5-氟尿嘧啶組:細(xì)胞培養(yǎng)方法同結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組,加入濃度為30μmol/L 的5-氟尿嘧啶[7];桃葉珊瑚苷低、高劑量組的細(xì)胞培養(yǎng)方法同結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組,分別加入濃度為50、100μmol/L 的桃葉珊瑚苷[8]。以上各組每孔設(shè)6 個平行樣,培養(yǎng)72h。

    1.4細(xì)胞增殖測定 將細(xì)胞以每孔2×104個的密度接種到96 孔板中,每孔加入100μg MTT 試劑,孵育4h,然后加入150μL DMSO,使用酶標(biāo)儀測量在490nm 處的吸光度OD 值來評估活細(xì)胞的數(shù)目。計算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值)/(對照組OD 值-空白組OD 值)×100%,空白組含有培養(yǎng)液、MTT、DMSO。

    1.5細(xì)胞凋亡水平測定 使用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶雙重染色檢測細(xì)胞凋亡。收集每組中的細(xì)胞,消化并重懸于PBS 中,根據(jù)試劑盒提供的方案,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,在流式細(xì)胞儀圖中,左下象限代表細(xì)胞碎片,而右下象限和右上象限分別代表早期和晚期凋亡細(xì)胞,左上象限對應(yīng)死細(xì)胞。根據(jù)以下公式,將每組的凋亡率計算為三個獨(dú)立測量值的平均值:凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

    1.6細(xì)胞侵襲遷移水平測定 在Transwell 腔室系統(tǒng)中進(jìn)行Matrigel 跨膜侵襲測定。將完全培養(yǎng)基添加到用Matrigel 預(yù)處理的Transwell 板的上腔室中,然后將含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基添加到下腔室中,在37℃下孵育1h,以1×105個/mL 的細(xì)胞密度懸浮,并將200μL 懸浮液轉(zhuǎn)移至上室,然后孵育24h。隨后,收集濾膜上的細(xì)胞,結(jié)晶紫染液染色,并在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞數(shù)目。

    1.7細(xì)胞SCAP、SREBP-1 mRNA 水平測定 Trizol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,使用熒光定量PCR 試劑進(jìn)行反應(yīng),SCAP、SREBP-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海陽光生物科技有限公司合成,序列如下:SCAP 正 向:5'-GTTCACGGACATGGAGCACGA-3',反向:5'-GTGGCTCTTGATGATCAGGTC-3';SREBP-1 正向:5'-GAAGGGAGTGACCATCATCG-3',反向:5'-TTAAAGCACCCAGGCTTGAT-3';GAPDH 正 向:5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',反 向:5'-GCCATCACGCCACAGTTTCCAT-3'。SCAP、SREBP-1 mRNA 的表達(dá)水平通過2-△△Ct 方法確定。PCR 總反應(yīng)體系(10μL)為:SYBR Premix Ex Taq 4μL,cDNA 模板1μL,正向引物0.5μL,反向引物0.5μL,去離子水4μL。循環(huán)條件為:95℃30s,95℃10s 和60℃30s,共40 個循環(huán)系統(tǒng)。

    1.8細(xì)胞SCAP、SREBP-1 蛋白水平測定 細(xì)胞在含有苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀液中裂解,然后以12000r/min,4℃離心15min,收集上清液,并使用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,將相同量的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,將印跡膜用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1h,再在4℃下與SCAP、SREBP-1、GAPDH 一抗(稀釋比1∶1000)孵育過夜,然后在室溫下與鼠抗人二抗(稀釋比1∶3000)孵育1h。最后,通過超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測免疫反應(yīng)性,使用Image J 軟件進(jìn)行條帶強(qiáng)度的檢測和定量。

    1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞OD 值、存活率比較與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組、桃葉珊瑚苷低、高劑量組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞OD 值、存活率降低(P 均<0.05);與5-氟尿嘧啶組比較,桃葉珊瑚苷低、高劑量組OD 值、存活率升高(P 均<0.05);與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,桃葉珊瑚苷高劑量組OD 值、存活率更低(P<0.05)。見表1。

    表1 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞OD 值、存活率比較(±s)

    表1 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞OD 值、存活率比較(±s)

    注:5-氟尿嘧啶組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶;桃葉珊瑚苷低劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+50μmol/L 的桃葉珊瑚苷;桃葉珊瑚苷高劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+100μmol/L 的桃葉珊瑚苷;OD 值為吸光度;與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,aP<0.05;與5-氟尿嘧啶組比較,bP<0.05;與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,cP<0.05

    2.2各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡率比較 與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組、桃葉珊瑚苷低、高劑量組凋亡率升高(P 均<0.05);與5-氟尿嘧啶組比較,桃葉珊瑚苷低、高劑量組凋亡率降低(P均<0.05);與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,桃葉珊瑚苷高劑量組凋亡率較高(P<0.05)。見表2。

    表2 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    表2 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    注:5-氟尿嘧啶組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶;桃葉珊瑚苷低劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+50μmol/L 的桃葉珊瑚苷;桃葉珊瑚苷高劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+100μmol/L 的桃葉珊瑚苷;與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,aP<0.05;與5-氟尿嘧啶組比較,bP<0.05;與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,cP<0.05

    2.3各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞侵襲遷移能力比較與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組、桃葉珊瑚苷低、高劑量組穿膜數(shù)降低(P 均<0.05);與5-氟尿嘧啶組比較,桃葉珊瑚苷低、高劑量組穿膜數(shù)升高(P 均<0.05);與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,桃葉珊瑚苷高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05)。見表3、圖1。

    圖1 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞穿膜數(shù)數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色×200)

    表3 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞侵襲遷移能力比較(個,±s)

    表3 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞侵襲遷移能力比較(個,±s)

    注:5-氟尿嘧啶組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶;桃葉珊瑚苷低劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+50μmol/L 的桃葉珊瑚苷;桃葉珊瑚苷高劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+100μmol/L 的桃葉珊瑚苷;與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,aP<0.05;與5-氟尿嘧啶組比較,bP<0.05;與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,cP<0.05

    2.4各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞SCAP、SREBP-1 mRNA表達(dá)水平比較 與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組、桃葉珊瑚苷低、高劑量組SCAP、SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平降低(P 均<0.05);與5-氟尿嘧啶組比較,桃葉珊瑚苷低、高劑量組SCAP、SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平升高(P 均<0.05);與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,桃葉珊瑚苷高劑量組SCAP、SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表4。

    表4 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞SCAP、SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平比較(±s)

    表4 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞SCAP、SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平比較(±s)

    注:5-氟尿嘧啶組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶;桃葉珊瑚苷低劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+50μmol/L 的桃葉珊瑚苷;桃葉珊瑚苷高劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+100μmol/L 的桃葉珊瑚苷;SCAP 為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白;SREBP-1 為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1;與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,aP<0.05;與5-氟尿嘧啶組比較,bP<0.05;與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,cP<0.05

    2.5各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞SCAP、SREBP-1 蛋白表達(dá)水平比較 與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組、桃葉珊瑚苷低、高劑量組SCAP、SREBP-1蛋白表達(dá)水平降低(P 均<0.05);與5-氟尿嘧啶組比較,桃葉珊瑚苷低、高劑量組SCAP、SREBP-1 蛋白表達(dá)水平升高(P 均<0.05);與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,桃葉珊瑚苷高劑量組SCAP、SREBP-1 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表5、圖2。

    圖2 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞SCAP、SREBP-1 蛋白表達(dá)水平比較

    表5 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞SCAP、SREBP-1 蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    表5 各組結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞SCAP、SREBP-1 蛋白表達(dá)水平比較(±s)

    注:5-氟尿嘧啶組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶;桃葉珊瑚苷低劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+50μmol/L 的桃葉珊瑚苷;桃葉珊瑚苷高劑量組為結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞+100μmol/L 的桃葉珊瑚苷;SCAP 為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白;SREBP-1 為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1;與結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組比較,aP<0.05;與5-氟尿嘧啶組比較,bP<0.05;與桃葉珊瑚苷低劑量組比較,cP<0.05

    3 討論

    桃葉珊瑚苷是一種重要的生物活性物質(zhì),具有清濕熱、利小便、鎮(zhèn)痛、降壓、保肝護(hù)肝、抗腫瘤等作用,能促進(jìn)肝細(xì)胞再生,明顯抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制[9]。有研究提示,桃葉珊瑚苷可能通過結(jié)合RXRa抑制腫瘤β-catenin 信號表達(dá)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),5-氟尿嘧啶組、桃葉珊瑚苷低、高劑量組OD 值、存活率、穿膜數(shù)低于結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組,凋亡率高于結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組。說明桃葉珊瑚苷能明顯抑制人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞增殖、侵襲,促進(jìn)其凋亡。

    研究發(fā)現(xiàn),許多癌細(xì)胞顯示出高水平的脂滴,包括結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌和前列腺癌等[11]。調(diào)節(jié)葡萄糖代謝抑制脂肪形成可能會阻止腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。在分子水平上,許多與從頭脂肪酸合成有關(guān)的基因在癌細(xì)胞中高表達(dá),并與多種惡性表型有關(guān)[12]。脂肪酸合酶(FASN),ATP 檸檬酸裂合酶(ACL),乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)是涉及從頭脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。積累的證據(jù)表明,參與脂肪形成的SCAP/SREBP 途徑異常通常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[13]。SREBPs 是控制脂肪形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。SCAP 通過將SREBP 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體來激活SREBP。Insig 與SCAP 的結(jié)合可防止高爾基體運(yùn)輸和激活SREBP。在高爾基體中,位點(diǎn)1 和2 的蛋白酶(S1P 和S2P)順序切割SREBPs 釋放其N 末端結(jié)構(gòu)域,后者進(jìn)入細(xì)胞核,導(dǎo)致參與脂質(zhì)合成和攝取的基因轉(zhuǎn)錄。SREBPs 靶向脂肪酶的過度表達(dá)導(dǎo)致異常的新生脂質(zhì)產(chǎn)生,持續(xù)的脂質(zhì)消耗和不受限制的細(xì)胞生長。在本研究中,桃葉珊瑚苷處理后結(jié)腸癌細(xì)胞中SREBP-1 激活受到抑制。提示桃葉珊瑚苷可能通過SREBP-1 進(jìn)而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的脂肪生成。

    SCAP 是激活SREBPs 所需的完整膜蛋白。在缺乏SCAP 的細(xì)胞中,SREBPs 無法轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體,并在細(xì)胞質(zhì)中失活。據(jù)報道,SCAP 在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)并促進(jìn)線粒體呼吸,脂肪抑制素對SCAP的抑制可削弱SREBP 活性,并顯著減弱人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長[14]。為探討桃葉珊瑚苷是否通過SCAP 調(diào)節(jié)SREBP-1 的活化,本研究進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶組、桃葉珊瑚苷低、高劑量組SCAP、SREBP-1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平低于結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞組。這說明SCAP、SREBP-1 相互作用的一致性。桃葉珊瑚苷處理后結(jié)腸癌細(xì)胞中SCAP 與SREBP-1 相互表達(dá)減弱。

    綜上所述,桃葉珊瑚苷能明顯抑制人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞增殖、侵襲,促進(jìn)其凋亡;其機(jī)制可能與桃葉珊瑚苷抑制SCAP/SREBP-1 通路的激活有關(guān)。

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