水分脅迫對(duì)千金子種子萌發(fā)及生理生化特性的影響

薛靜怡， 楊浩娜， 唐 易， 彭亞軍， 王立峰

(1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院， 長(zhǎng)沙 410082；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 長(zhǎng)沙 410125)

千金子[Leptochloachinensis(L.) Nees]是世界性農(nóng)田惡性雜草，嚴(yán)重影響水稻生長(zhǎng)，具有繁殖力強(qiáng)、旱生喜濕等特性。與水稻相比，千金子的分蘗多，且種子量大，平均每株結(jié)籽4.5萬粒，具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力[1-3]。目前防治千金子以氰氟草酯等化學(xué)藥劑防除為主，但化學(xué)藥劑防除對(duì)千金子防治效果不佳，且環(huán)境污染問題嚴(yán)重[3]。千金子在萌發(fā)時(shí)期不耐水淹，水分條件對(duì)其萌發(fā)的影響較大[2]。而稻田可用水資源充足，建立適宜水層，在一定程度上可以抑制千金子出草量。

應(yīng)對(duì)脅迫植物自身會(huì)產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)，這類物質(zhì)包括脯氨酸和可溶性蛋白等[4]。植物正常生長(zhǎng)時(shí)，在呼吸作用和光合作用中會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)[5]。水分脅迫等環(huán)境脅迫條件下會(huì)增加ROS的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，過量的ROS通過氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA來干擾正常的細(xì)胞新陳代謝[6]。氧化應(yīng)激可能使植物細(xì)胞膜脂發(fā)生脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，導(dǎo)致較多的丙二醛(MDA)產(chǎn)生；植物有一系列的酶協(xié)同工作來清除不同細(xì)胞器中的ROS[5]。通過探究水分脅迫對(duì)脯氨酸、可溶性蛋白、MDA和抗氧化酶等生理生化指標(biāo)的影響，可以了解千金子種子應(yīng)對(duì)水分脅迫、在維持滲透調(diào)節(jié)平衡和活性氧代謝平衡中的響應(yīng)。本試驗(yàn)研究了水分脅迫對(duì)千金子種子萌發(fā)及生理生化特性的影響，旨在全面了解千金子種子應(yīng)對(duì)水分脅迫的響應(yīng)，探索抑制千金子種子萌發(fā)的適宜水分條件，為環(huán)保安全的防控千金子提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試千金子種子于2018年6月30日在湖南省常德市漢壽縣(29°4′N，111°59′E)采集。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選顆粒飽滿的千金子種子1 000粒，用4 ℃無菌水浸泡24 h催芽，吸去多余水分備用。試驗(yàn)在溫度為32 ℃，12 h(光)/12 h(暗)，光照強(qiáng)度為12 000 lx的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。采用購于廣東華興石英砂廠的石英砂作為發(fā)芽介質(zhì)，粒徑為0.15～0.4 mm，在使用前經(jīng)過如下處理：a.洗滌；b.消毒：將洗凈的濕砂在130～170 ℃高溫下烘干約2 h；c.加水拌勻。

實(shí)驗(yàn)前測(cè)定所用石英砂的飽和含水量，設(shè)置6個(gè)水分處理, 包括干旱處理和淹水處理。分別為砂床飽和含水量的50%(T 1)、75%(T 2)和100%(T 3)，以及0.5 cm(T 4)、1 cm(T 5)和1.5 cm(T 6)的淹沒處理。其中T 3為水分正常處理，也可以視為0 cm的淹水處理；T 1和T 2為干旱處理，T 4、T 5和T 6為淹水處理。計(jì)算6個(gè)水分處理所需的水量，在石英砂中分別加入相應(yīng)含水量的蒸餾水，混合均勻后分裝至200 mL塑料杯中，每杯均勻放入30粒種子，播種在砂床0.5 cm處，每個(gè)處理3次重復(fù)。使用保鮮膜將塑料杯封口，最后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。間隔12 h稱重法定量補(bǔ)充蒸餾水，將蒸餾水加入到塑料杯內(nèi)至原重量，以保持水分含量不變。

種子發(fā)芽以種子的胚根長(zhǎng)達(dá)到種子長(zhǎng)度，且胚芽達(dá)到種子長(zhǎng)度的一半為標(biāo)準(zhǔn)[7]。

發(fā)芽勢(shì)(%)=[(發(fā)芽初期(規(guī)定日期內(nèi))發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))]×100%；

發(fā)芽率(%)=[(發(fā)芽終期(規(guī)定日期內(nèi))發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))]×100%。

此次試驗(yàn)發(fā)芽初期為3 d，發(fā)芽終期為7 d。在第7天每個(gè)處理取30粒種子，用體式顯微鏡拍照，并用全自動(dòng)超景深數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)(機(jī)型：德國蔡司Smart Zoom 5)對(duì)胚根、胚芽的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1砂床飽和含水量的測(cè)定

取一底部為鐵絲網(wǎng)的圓柱體，鐵絲網(wǎng)上放一層濕潤濾紙，稱重為W1；在圓柱體中加滿砂，砂上放一層干濾紙，稱重為W2；將圓柱體置一水盆中，水面剛好淹至底部鐵絲網(wǎng)，在砂上干濾紙中部剛好濕潤時(shí)移開圓柱體，稱重為W3，則砂床飽和含水量(%)=[(W3-W2)/(W2-W1)]×100%[7]。

1.3.2脯氨酸與可溶性蛋白含量的測(cè)定

將約0.2 g千金子種子樣品液氮研磨，加3%的磺基水楊酸溶液5 mL，沸水浴15 min，自然冷卻后取上清液，采用酸性水合茚三酮顯色法進(jìn)行脯氨酸的測(cè)定[8]?？扇苄缘鞍缀康臏y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)(G-250)法[9]，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3.3MDA含量的測(cè)定

將約0.1 g千金子種子樣品液氮研磨，加0.05 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH=7.8)5 mL，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，采用硫代巴比妥酸顯色法進(jìn)行MDA含量的測(cè)定[10]。

1.3.4抗氧化酶活性的測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法[11]。過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法[12]。過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定采用可見光鉬酸銨法[11]。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3.5數(shù)據(jù)處理與分析

采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有數(shù)據(jù)。ANOVA單因素方差分析，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對(duì)千金子種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

T 1和T 2處理下千金子種子極少發(fā)芽，大部分種子種皮未開裂，部分種子只長(zhǎng)出胚根，胚芽未長(zhǎng)出(圖1 a，b)。T 3和T 4處理下千金子種子普遍發(fā)芽，胚芽與胚根均正常生長(zhǎng)(圖1 c，d)。T 5和T 6處理下千金子種子部分發(fā)芽，胚根生長(zhǎng)緩慢，胚芽顯著長(zhǎng)于胚根(圖1 e，f)。

從表1可以看出，隨水分增加，胚根長(zhǎng)先增加后下降，T 4處理的胚根最長(zhǎng)；隨水分增加，胚芽長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)， T 6處理的胚芽最長(zhǎng)；胚根胚芽比先降低后增加再下降，T 1處理的胚根胚芽比最長(zhǎng)。對(duì)胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、肧根胚芽比3個(gè)種子萌發(fā)指標(biāo)分別進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)T 3、T 4、T 5和T 6處理的胚根長(zhǎng)差異不顯著(p>0.05)，T 1、T 2、T 5和T 6處理的胚根長(zhǎng)差異不顯著(p>0.05)；T 1和T 2處理的胚芽長(zhǎng)與T 3、T 4、T 5和T 6處理之間差異顯著(p<0.05)；T 1處理的胚根胚芽比與其他處理之間均差異顯著(p<0.05)，T 5和T 6處理的胚根胚芽比顯著降低，與其他處理差異顯著(p<0.05)。這可能是由于胚根對(duì)水多缺氧條件的反應(yīng)比胚芽更為敏感[7]。種子萌動(dòng)時(shí)，胚的生長(zhǎng)隨水分供應(yīng)情況不同而存在差異。當(dāng)水分相對(duì)少時(shí)，胚根先出；當(dāng)水分過多時(shí)，胚芽先出，較胚根生長(zhǎng)迅速。

表1 不同水分處理對(duì)千金子種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different water treatments on seed germination of L. chinensis

如圖2所示，千金子種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)呈先上升再下降的變化趨勢(shì)。T 1處理千金子種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)極低，僅為19.44%和11.11%。T 3處理下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)都達(dá)到最高值，之后隨著水分的增加，千金子種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)都逐漸下降。對(duì)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)水分處理對(duì)發(fā)芽率影響均差異顯著(p<0.05)；T 3和T 4處理的發(fā)芽勢(shì)之間的差異顯著(p<0.05)，T 2、T 5和T 6處理的發(fā)芽勢(shì)之間差異不顯著(p>0.05)，T 1和T 6處理的發(fā)芽勢(shì)之間的差異不顯著(p>0.05)。由于T 5與T 6處理的發(fā)芽勢(shì)差異不顯著(p>0.05)，在實(shí)際生產(chǎn)中為避免抑制同環(huán)境下作物發(fā)芽率，可以選擇T 5處理抑制千金子的發(fā)芽來達(dá)到早期防控的目的。

2.2 水分脅迫對(duì)脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

應(yīng)對(duì)脅迫種子自身會(huì)產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)，滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)可以維持種子細(xì)胞的水分平衡，保證種子的正常生長(zhǎng)，這類物質(zhì)包括脯氨酸和可溶性蛋白等[4]。如圖3所示，隨水分增加，千金子種子的脯氨酸和可溶性蛋白含量都呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，都在T 3處理時(shí)達(dá)到最小值。可溶性蛋白任意兩水分處理下的指標(biāo)含量差異顯著(p<0.05)；T 1和T 5處理的脯氨酸含量之間的差異不顯著(p>0.05)。脯氨酸含量在T 6處理時(shí)達(dá)到最大值，可溶性蛋白含量在T 1處理時(shí)達(dá)到最大值，說明T 3水分正常處理下產(chǎn)生的滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)含量顯著低于其他處理，在干旱和淹水脅迫下滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)含量升高，可以提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力。不同處理間脯氨酸含量表現(xiàn)為：T 6>T 1>T 5>T 2>T 4>T 3，說明淹水脅迫產(chǎn)生了更多的脯氨酸。不同處理間可溶性蛋白含量表現(xiàn)為：T 1>T 2>T 6>T 5>T 4>T 3，說明T 1和T 2干旱處理產(chǎn)生了更多的可溶性蛋白。隨干旱和淹水脅迫程度的加深，脯氨酸和可溶性蛋白的含量呈增加趨勢(shì)。

2.3 水分脅迫對(duì)MDA含量的影響

水分脅迫可能會(huì)引起種子活性氧代謝失控，種子細(xì)胞膜脂可能會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，導(dǎo)致較多的MDA產(chǎn)生，可以將MDA作為描述種子細(xì)胞膜脂過氧化程度的指標(biāo)[4]。從圖4可以看出，隨水分增加，千金子種子的MDA含量總體呈先降后升的變化趨勢(shì)，且任意兩水分處理下的指標(biāo)含量差異顯著(p<0.05)。

T 3處理MDA的含量最低， T 6處理MDA的含量最高，說明T 3處理?xiàng)l件下膜脂質(zhì)過氧化程度最低，MDA含量隨脅迫程度的加深呈增加的趨勢(shì)。T 1、T 2、T 4、T 5和T 6處理之間差異顯著，且T 1>T 6>T 2>T 5>T 4 ，MDA的含量隨脅迫程度的加深呈增加趨勢(shì)。

2.4 水分脅迫對(duì)抗氧化酶活性的影響

種子細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能調(diào)動(dòng)多種保護(hù)酶應(yīng)對(duì)脅迫，清除內(nèi)部的過氧化物和自由基，以維持正常生長(zhǎng)。細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)常見的保護(hù)酶有SOD，POD等[13]。

如圖5所示，隨水分增加，千金子種子的SOD和POD活性總體呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，均在T 1處理達(dá)到最大值，在T 3處理達(dá)到最小值。任意兩水分處理下的SOD和POD活性差異顯著(p<0.05)。SOD與POD二者最低值均出現(xiàn)在T 3，說明隨干旱或淹水脅迫加重，SOD和POD活性增加，可加速分解種子內(nèi)部產(chǎn)生的超氧自由基，減緩膜脂過氧化速度，與上述MDA含量的變化一致。不同處理間SOD活性表現(xiàn)為：T 1>T 6>T 2>T 5>T 4>T 3，說明重度的干旱和淹水脅迫(T 1和T 6)下SOD活性較輕度脅迫(T 2、T 4和T 5)表現(xiàn)為不同程度的升高，與上述MDA的現(xiàn)象相符。且重度的干旱和淹水脅迫不利于種子的自我調(diào)節(jié)修復(fù)，表現(xiàn)為發(fā)芽率的降低。不同處理間POD活性表現(xiàn)為：T 1>T 2>T 6>T 5>T 4>T 3，說明淹水脅迫下的POD活性較干旱脅迫低。

3 討論與結(jié)論

溫度、光照和水分對(duì)千金子的萌發(fā)至關(guān)重要，千金子一般在夏季萌發(fā)，此時(shí)的溫度和光照條件均適宜千金子種子萌發(fā)和生長(zhǎng)，因此水分就成為影響千金子萌發(fā)出苗的關(guān)鍵因子[2]。

本研究中，在T 1處理下千金子種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最低，在T 3處理下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最高，之后隨著水分的增加，千金子種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)都下降。說明種子受到干旱脅迫時(shí)，顯著抑制種子的發(fā)芽；種子受到淹水脅迫時(shí)，也對(duì)種子的發(fā)芽有一定程度的抑制。T 1處理時(shí)胚根/胚芽最大，T 6處理時(shí)胚根/胚芽最小，隨著水分的增加，呈先降低后增加再降低的趨勢(shì)。說明干旱脅迫下，胚根較胚芽?jī)?yōu)先生長(zhǎng)，可以通過胚根吸收能力的提高緩解干旱脅迫[14]；淹水脅迫下，由于胚根對(duì)氧的利用減少，胚根的細(xì)胞進(jìn)行無氧呼吸，乙醇等有害物質(zhì)大量積累，導(dǎo)致根系細(xì)胞死亡[15]。

研究表明，植物受到水分脅迫后，會(huì)造成滲透脅迫，細(xì)胞可通過合成更多的可溶性蛋白和脯氨酸使植物細(xì)胞滲透勢(shì)增加，提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力以維持正常生長(zhǎng)[15]。本實(shí)驗(yàn)中，脯氨酸含量在T 6處理時(shí)達(dá)到最大值，可溶性蛋白含量在T 1處理時(shí)達(dá)到最大值。淹水脅迫產(chǎn)生了更多的脯氨酸，T 1處理和T 2處理干旱處理產(chǎn)生了更多的可溶性蛋白。

當(dāng)植物處于適宜的環(huán)境條件下，ROS的產(chǎn)生和清除存在動(dòng)態(tài)平衡，植物受到環(huán)境脅迫后ROS的代謝平衡被打破，ROS含量升高導(dǎo)致MDA積累，使膜脂質(zhì)過氧化[15-16]。植物會(huì)通過啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)與ROS平衡相關(guān)的抗氧化系統(tǒng)，如抗氧化酶系清除過量的ROS從而降低膜脂的過氧化損傷[17]。本研究中，MDA含量總體呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，T 3處理MDA的含量最低，T 6處理MDA的含量最高；T 1>T 6>T 2>T 5>T 4>T 3，說明干旱與淹水脅迫均導(dǎo)致種子內(nèi)部活性氧代謝平衡被打破，導(dǎo)致MDA含量的增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷。本試驗(yàn)中，SOD與POD的活性在T 1處理下最高，活性隨水分增加降低，在T 3處理下達(dá)到最小值，之后隨水分增加逐漸升高，且SOD和POD活性隨干旱或淹水脅迫加重都表現(xiàn)為不同程度的升高。

綜上所述，干旱能顯著抑制千金子種子發(fā)芽，淹水脅迫也對(duì)種子發(fā)芽有一定程度的抑制，且干旱處理下胚根較胚芽?jī)?yōu)先生長(zhǎng)，淹水處理下缺少氧氣胚根緩慢生長(zhǎng)。在干旱和淹水脅迫下脯氨酸和可溶性蛋白含量較T 3處理顯著升高，且與脅迫程度呈正比。隨干旱或淹水脅迫程度的加深，MDA的含量增加，相應(yīng)的SOD和POD的活性也增加，以進(jìn)行自我調(diào)節(jié)修復(fù)。由于T 5處理與T 6處理的發(fā)芽勢(shì)差異不顯著(p>0.05)，T 1處理與T 5處理的脯氨酸含量差異不顯著(p>0.05)，T 4處理與T 5處理的可溶性蛋白、脯氨酸和MDA含量以及SOD和POD活性之間的差異顯著(p<0.05)，且在實(shí)際生產(chǎn)中為避免抑制同環(huán)境下作物發(fā)芽率，推薦選擇T 5處理(淹水1 cm)抑制千金子種子的發(fā)芽來達(dá)到早期防控千金子的目的。