益氣解毒方中苯丙素類化合物對鼻咽癌 細胞增殖效應的影響

熊雨 劉潔 鄒攀 蘇芮 鐘文良 江志超 王賢文 何迎春

〔摘要〕 目的 探討益氣解毒方中苯丙素類化合物異歐前胡素、阿魏酸、綠原酸對人鼻咽癌CNE2細胞增殖效應的抑制作用及機制研究。方法 使用實時無標記細胞功能分析技術（RTCA）動態(tài)監(jiān)測不同濃度的3種苯丙素類化合物對離體人鼻咽癌CNE2細胞生長曲線的影響;CytationTM 5高通量活細胞成像分析檢測系統(tǒng)分別監(jiān)測3種不同濃度苯丙素類化合物對人鼻咽癌CNE2細胞形態(tài)改變;Western blot法檢測3種苯丙素類化合物對人鼻咽癌CNE2細胞增殖相關蛋白增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）、X連鎖的凋亡蛋白抑制劑（X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP）、Survivin表達的影響。結(jié)果 RTCA實時監(jiān)測結(jié)果顯示異歐前胡素、阿魏酸、綠原酸均能不同程度地抑制CNE2細胞增殖，存在藥物濃度越高抑制效應越明顯的趨勢。CytationTM 5檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，3種苯丙素類化合物作用36 h后，大量CNE2細胞出現(xiàn)細胞漂浮死亡，細胞膜破潰、細胞結(jié)構模糊等形態(tài)變化。Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，異歐前胡素、阿魏酸、綠原酸能明顯抑制CNE2細胞中增殖相關蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表達（P<0.05）。結(jié)論 益氣解毒方中主要苯丙素類化合物異歐前胡素、阿魏酸、綠原酸均可以不同程度抑制人鼻咽癌CNE2細胞增殖，其機制可能與下調(diào)增殖相關蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表達有關。

〔關鍵詞〕 鼻咽癌;益氣解毒方;苯丙素類化合物;細胞增殖;異歐前胡素;阿魏酸;綠原酸

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.009

Effects of the Phenylpropanoids in Yiqi Jiedu Formula on the Proliferation of

Nasopharyngeal Carcinoma Cells

XIONG Yu1， LIU Jie1， ZOU Pan1， SU Rui1， ZHONG Wenliang1， JIANG Zhichao2， WANG Xianwen3，4，5， HE Yingchun1，4，5*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Brain Hospital of Hunan Province， Changsha， Hunan 410005， China; 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 4. Hunan Provincial Engineering and Technological Research Center for Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Chinese Medicine and Protecting Visual Function， Changsha， Hunan 410208， China; 5. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the inhibitory effect and mechanism of the phenylpropanoid compounds isoimperatorin， ferulic acid and chlorogenic acid in Yiqi Jiedu Formula on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells.? Methods Real-time unlabeled cell function analysis technique （RTCA） was used to dynamically monitor the effects of three phenylpropanoids at different concentrations on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. CytationTM 5 high-throughput live cell imaging analysis system was used to monitor the effects of three phenylpropanoids at different concentrations on the morphological changes of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Western blot method was used to detect the effects of three phenylpropanoids on human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， X-linked inhibitor of apoptosis protein （XIAP）， and Survivin expression. Results RTCA results showed that isoperatorin， ferulic acid， and chlorogenic acid can inhibit the proliferation of CNE2 cells to varying degrees， and there was a trend that the higher the drug concentration， the more obvious the inhibitory effect. The CytationTM 5 results showed that compared with the control group， a large number of CNE2 cells had cell floating death， cell membrane rupture， cell structure fuzzy and other morphological changes after the three phenylpropanoids were treated for 36 hours. Western blot detection results showed that compared with the control group， isoperatorin， ferulic acid， and chlorogenic acid can significantly inhibit the expression of proliferation-related proteins PCNA， XIAP， and Survivin in CNE2 cells （P<0.05）. Conclusion The main phenylpropanoid compounds， isoimperatorin， ferulic acid and chlorogenic acid in Yiqi Jiedu Formula， which can inhibit the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells to varying degrees. The mechanism may be related to the down-regulation of proliferation-related proteins PCNA， XIAP， and Survivin expression level.

〔Keywords〕 nasopharyngeal carcinoma; Yiqi Jiedu Formula; phenylpropanoid compounds; cell proliferation; isoimperatorin; ferulic acid; chlorogenic acid

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）為發(fā)生在鼻咽上皮內(nèi)壁的頭頸部高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率具有明顯的地域傾向和種族差異，在中國南方、北非和東南亞發(fā)病率較高[1]。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療NPC患者方面有獨特優(yōu)勢，和單純放療相比，中西醫(yī)結(jié)合療法能有效改善NPC患者口腔黏膜不良反應、胃腸道不良反應及唾液腺損傷情況等，并能有效提高患者生活質(zhì)量[2]。益氣解毒方是本課題組研究和應用了二十幾年的經(jīng)驗方，為田道法教授等針對NPC的“氣虛染毒”的中醫(yī)病機，根據(jù)“益氣解毒，生津潤燥”立法研制，課題組前期研究[3-4]已驗證益氣解毒方可以有效抑制NPC細胞增殖。益氣解毒方中苯丙素類化合物來自黨參異歐前胡素（isoimperatorin）及君藥黃連中阿魏酸（ferulic acid）、綠原酸（chlorogenic acid），已有研究發(fā)現(xiàn)這幾類中藥單體具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性，對多種腫瘤細胞株具有抑增殖促凋亡效應[5-8]。

為了進一步佐證益氣解毒方中苯丙素類化合物異歐前胡素、阿魏酸、綠原酸對人離體NPC細胞株增殖效應的影響及機制，本研究通過實時無標記細胞功能分析技術（real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA）、CytationTM 5細胞成像實時監(jiān)測、Western blot等分別從整體效應、形態(tài)變化及蛋白質(zhì)表達水平探討這些中藥單體對NPC CNE2細胞增殖效應作用，進一步闡明益氣解毒方的藥效發(fā)揮機制。

1 材料

1.1? 細胞株

人NPC細胞株CNE2（BNCC341794），購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，由本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.2? 藥物與試劑

異歐前胡素（質(zhì)量分數(shù)≥98%，20180522）、阿魏酸（質(zhì)量分數(shù)≥98%，20160519）、綠原酸（質(zhì)量分數(shù)

≥98%，20180311）均購自上海金穗生物科技有限公司;抗體β-actin（3700S）、XIAP（14334P）、Survivin（2808S）均購自美國CST公司;PCNA抗體（bs-0754R， 北京博奧森生物技術有限公司）;IRDye 680RD 羊抗鼠二抗（C70417-02）、IRDye 800CW羊抗兔二抗（C70420-01）均購自美國LI-COR公司;RPMI-1640培養(yǎng)基（AE29163437）、PBS緩沖液（SH30256.01B）均購自美國HyClone公司;青霉素-鏈霉素溶液（WH01112004XP）、含0.25%EDTA胰蛋白酶溶液（WH01122008XP）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清（42A0378K）購自美國Gibco公司。

1.3? 實驗儀器

雙人單面潔凈工作臺（SJ-CJ-2FD，蘇州蘇潔凈化設備有限公司）;二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（CCL-170B-8，新加坡ESCO公司）;醫(yī)用離心機（L535R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司）;倒置相差生物顯微鏡（AE31，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）;實時無標記細胞分析儀（RTCA DP，美國ACEA公司）;多功能微孔板檢測系統(tǒng)（CytationTM 5，美國BioTek公司）;紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（ODYSSEY CLx，美國LI-COR公司）。

2 方法

2.1? 細胞培養(yǎng)

使用含有10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CNE2細胞，置于37 ℃、5% CO2及濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時換液，每2～3 d傳代1次。

2.2? 實時無標記細胞功能分析儀（RTCA）監(jiān)測細胞增殖

取3塊RTCA檢測專用E-plate板，每孔各加入50 μL培養(yǎng)基，置于儀器中測量基線、平衡儀器。取對數(shù)生長期的CNE2細胞，37 ℃胰酶消化2 min，制成單細胞懸液，將細胞混勻后接種于E-plate板中，每孔100 μL細胞懸液，控制細胞密度為5 000個/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設5個復孔。實驗分組：每個藥物分別設對照組和1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L共7組。接種后培養(yǎng)約12 h，細胞貼壁生長，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μL含藥培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，RTCA持續(xù)監(jiān)測72 h以上[7-8]。RTCA監(jiān)測系統(tǒng)可通過自動計算細胞指數(shù)（cell index， CI）反映細胞增殖情況，CI=（Rn-Rb）/15，其中，Rn表示孔接種細胞后的電極阻抗值，Rb為背景阻抗基線值，進而繪制出細胞生長曲線。根據(jù)加藥后24、36、48、60、72 h的均一化細胞指數(shù)，計算藥物相對增殖率，增殖率=（實驗組均一化細胞指數(shù)/對照組均一化細胞指數(shù)）×100%。

2.3? CytationTM 5多功能細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)監(jiān)測細胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的CNE2細胞，37 ℃胰酶消化2 min，制成單細胞懸液，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，控制細胞密度為5 000個/孔，細胞貼壁生長，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μL含藥培養(yǎng)基或含溶劑培養(yǎng)基，實驗分組：對照組、異歐前胡素組、阿魏酸組、綠原酸組，藥物組濃度均為20 μmol/L。將96孔板放置于CytationTM 5檢測系統(tǒng)中37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，設定每6 h進行一次全板自動圖像捕獲及分析細胞形態(tài)圖像，監(jiān)測細胞生長形態(tài)。

2.4? Western blot檢測蛋白表達

取對數(shù)生長期的CNE2細胞，傳代至細胞培養(yǎng)皿中，細胞貼壁生長后棄去原培養(yǎng)液，加入含藥培養(yǎng)基或含溶劑培養(yǎng)基，實驗分組同“2.3”，置于37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)36 h后提取總蛋白并進行BCA定量，取50 μg蛋白配置上樣體系。根據(jù)檢測蛋白分子量配置合適濃度的分離膠和濃縮膠，上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。按照一定稀釋比例稀釋β-actin、PCNA、XIAP和Survivin，4 ℃過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min，再加入相對應的鼠二抗或兔二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，于ODYSSEY CLx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上掃描顯影，檢測不同處理組間目的條帶的信號值，計算相對表達量。

2.5? ?統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，使用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計圖的繪制，實驗數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示。兩組間數(shù)據(jù)比較使用獨立樣本T檢驗方法。各組間計量資料數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析方法分析，方差齊使用

LSD檢驗進行多重比較，方差不齊使用DunnettT3多重檢驗。

3 結(jié)果

3.1? 益氣解毒方中苯丙素類化合物對CNE2細胞增殖的影響

異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸均能不同程度地抑制CNE2細胞增殖，呈現(xiàn)出藥物濃度越高抑制效應越明顯的趨勢，同一藥物作用時間點，3種中藥單體的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）不同。藥物作用36 h后異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸的IC50分別為33.05、87.07、33.88 μmol/L。且這3種苯丙素類化合物抑制率出現(xiàn)明顯拐點均出現(xiàn)在加藥后36 h左右。見表1和圖1-3。

3.2? 益氣解毒方中苯丙素類化合物對CNE2細胞形態(tài)的影響

與對照組飽滿均勻，細胞結(jié)構完整的CNE2細胞形態(tài)相比，異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸處理后的大量細胞出現(xiàn)細胞膜破潰，細胞結(jié)構模糊等形態(tài)變化。與對照組相比異歐前胡素、阿魏酸處理的CNE2細胞抑制增殖的效應更顯著，加藥處理36 h后細胞增殖速度減慢并伴有大量細胞脫壁漂浮，細胞核固縮碎裂變形，胞內(nèi)容物外翻等形態(tài)變化，綠原酸則是加藥處理48 h后出現(xiàn)明顯形態(tài)變化。見圖4。

3.3? 益氣解毒方中苯丙素類化合物對CNE2細胞增殖相關蛋白的影響

與對照組相比，加藥組的細胞增殖相關蛋白PCNA及細胞生存蛋白Survivin、凋亡抑制蛋白XIAP表達量均不同程度的降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。見圖5。

4 討論

NPC的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程，發(fā)病機制復雜，包括EB病毒（epstein-barr virus， EBV）感染[9]、人乳頭瘤病毒感染[10-11]、遺傳易感性[12]等。NPC患者的早診斷早治療，提高晚期NPC患者的生存率及改善其生活質(zhì)量仍是NPC研究學者們關注的主要問題。已有大量前期研究[13-17]圍繞益氣解毒方對NPC細胞增殖、凋亡、自噬、遷移的作用和機制，益氣解毒方由黃芪、黨參、黃連、天花粉、白花蛇舌草、茯苓、甘草組成，體外能通過下調(diào)端粒酶的活性抑制細胞生長和誘導細胞凋亡，還可能通過抑制細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子、細胞分裂增殖、細胞周期、DNA修復和誘導細胞凋亡、促進壞死等信號通路，從而抑制細胞增殖和誘導細胞死亡，體內(nèi)可抑制裸鼠NPC移植瘤的形成等[8，18-19]。

益氣解毒方中主要含有三萜類化合物和苯丙素類化合物，如槲皮黃素、山柰酚、芒柄花黃素、黃連素、茯苓酸、黃芪甲苷、異歐前胡素、綠原酸、熊果酸、齊墩果酸、漢黃芩素、小檗堿、阿魏酸等成分[20]。課題組前期研究[21]發(fā)現(xiàn)益氣解毒方中三萜類化合物齊墩果酸、熊果酸、黃芪甲苷及茯苓酸對NPC CNE2細胞增殖效應的作用，證實其可以抑制CNE2細胞增殖。本研究主要比較益氣解毒方苯丙素類化合物。異歐前胡素對多種腫瘤細胞株具有抑增殖促凋亡效應[3-4]。阿魏酸可通過抑制腫瘤細胞能量代謝、發(fā)揮直接細胞毒作用、誘導細胞凋亡等起到抗癌作用[22]。同樣有大量研究發(fā)現(xiàn)綠原酸可在多種腫瘤中發(fā)揮抑制作用[5，23-24]。為了進一步探討益氣解毒方中苯丙素類化合物是否抑制了NPC CNE2細胞的增殖，三者之間效應有何不同，本研究通過監(jiān)測細胞增殖曲線、形態(tài)改變及增殖相關蛋白質(zhì)水平表達差異等方式進行研究。

RTCA通過監(jiān)測E-plate板孔內(nèi)電阻抗變化，分析得出的CI可以揭示細胞增殖、死亡、遷移等行為，有利于精確指導和改進實驗設計。CytationTM 5多功能細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)可實時監(jiān)測細胞形態(tài)并拍照記錄，對活細胞進行動態(tài)監(jiān)測與多維分析。PCNA是一個重要的細胞增殖相關蛋白，其可以在復制叉處協(xié)調(diào)大部分代謝反應，包括DNA復制和DNA修復等，還可以通過表皮生長因子受體（EGFR）在酪氨酸211（Y211）上的磷酸化修飾，PCNA過度表達及活化與多種癌癥發(fā)生發(fā)展有關[25]。凋亡抑制因子XIAP和細胞生存蛋白Survivin均可介導細胞增殖。本實驗通過RTCA監(jiān)測發(fā)現(xiàn)異歐前胡素、阿魏酸、綠原酸均能不同程度地抑制CNE2細胞增殖，并且呈現(xiàn)出藥物濃度越高抑制效應越明顯的趨勢，不同藥物單體發(fā)揮最佳藥效的時間不同，3種苯丙素類化合物抑制率出現(xiàn)明顯拐點均出現(xiàn)在加藥后36 h左右。藥物作用36 h后異歐前胡素、阿魏酸、綠原酸的IC50分別為33.05、87.07、33.88 μmol/L。CytationTM 5實時監(jiān)測結(jié)果顯示，對照組CNE2細胞形態(tài)飽滿均勻，細胞結(jié)構完整，異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸處理后的大量細胞出現(xiàn)細胞膜破潰，細胞結(jié)構模糊，細胞脫壁漂浮等形態(tài)異常變化。與對照組相比，加藥組的PCNA、XIAP及Survivin蛋白表達均下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

綜上，本研究表明，益氣解毒方中苯丙素類化合物異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸可以抑制人NPC CNE2細胞增殖。異歐前胡素抑制增殖效應出現(xiàn)較慢，但出現(xiàn)形態(tài)異常時間較早，且抑制增殖效應較明顯;綠原酸雖出現(xiàn)抑制增殖效應較早，抑制增殖效應較弱一些;阿魏酸抑制增殖效應及出現(xiàn)形態(tài)異常較早，但抑制增殖效應為三者中最弱。3種苯丙素類化合物均可損傷NPC CNE2細胞，使其細胞形態(tài)發(fā)生改變。異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸抑制NPC CNE2細胞增殖作用可能通過下調(diào)PCNA、XIAP及Survivin表達來完成。本研究對益氣解毒方中苯丙素類化合物異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸抑制NPC CNE2細胞增殖效應情況進行比較，并且對其機制進行初步研究，揭示益氣解毒方的藥效物質(zhì)基礎，明確益氣解毒方單體有效作用成分，豐富益氣解毒方應用于臨床的科學理論依據(jù)，更好的指導臨床用藥。今后的實驗將探索益氣解毒方內(nèi)主要苯丙素類化合物異歐前胡素、阿魏酸及綠原酸抑制NPC CNE2細胞增殖的更多分子機制。

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