丹酚酸A調(diào)控C3aR的表達(dá)治療缺血性疾病作用機(jī)制研究*

馬璐璐，陳璐，張璐莎，方樂玉，李春曉，張麗媛，楊文杰，王倩怡，王虹

天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津301617

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，為活血化瘀要藥［1－4］。丹酚酸A（salvianolic acid A，SAA）是丹參中一種主要的水溶性酚酸類化合物，其在心、腦血管病的治療方面具有重要的研究價(jià)值［5－8］。研究表明，SAA可以通過抑制血小板活化達(dá)到抗凝血的效果［9］，血小板表面過敏毒素C3a受體（anaphylatoxin C3a receptor，C3aR）屬于固有免疫系統(tǒng)中的補(bǔ)體成分，過敏毒素C3a與其關(guān)聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體C3aR結(jié)合后，促進(jìn)內(nèi)皮通透性，募集和激活中性粒細(xì)胞，觸發(fā)炎癥反應(yīng)和血栓形成［10－11］。SAA可以治療臨床缺血性疾病，且可能參與過敏毒素受體C3aR的表達(dá)，因此本研究構(gòu)建體外血小板和中性粒細(xì)胞活化模型，通過比濁法、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定法等檢測相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，探討SAA是否通過調(diào)控C3aR的表達(dá)抑制血小板活化、聚集、黏附及中性粒細(xì)胞脫顆粒治療臨床缺血性疾病，以期為臨床上治療缺血性疾病機(jī)制研究提供思路。

1 材料

1.1 動物SD大鼠，SPF級，雄性，40只，體質(zhì)量200～220 g；C57BL／6小鼠，SPF級，雄性，6～8周，40只；以上動物購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016－0002，飼養(yǎng)于溫度19～25℃，相對濕度40%～60%的環(huán)境下。

1.2 藥物及試劑丹酚酸A（純度＞99%，成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號：DST180201－008）；阿司匹林腸溶片（Asprin，每片0.1 g，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ27810）；二磷酸腺苷二鈉鹽（adenosine diphosphate，ADP，美國Sigma－Aldrich公司，批號：SLBN0134V）；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：R415）；APC anti－mouse／rat CD62p antibody（美國Biolegend公司，批號：148304）；水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：P1110）；小鼠中性粒細(xì)胞提取試劑盒（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號：LZS1091）；髓過氧化物酶（myloperoxidase，MPO）試劑盒、彈性蛋白酶（elastase，NE）試劑盒、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為：E－BC－K074－S、E－EL－M0444c、E－EL－M0746c、E－EL－M2732c）。

1.3 儀器Flex Station?3酶標(biāo)儀（美國Molecular Device公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；64R型低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 血小板懸液的制備采用5%水合氯醛麻醉SD大鼠，腹主動脈取血10 mL，放入盛有ACD（檸檬酸38 mmol·L－1、檸 檬 酸 鈉75 mmol·L－1、葡 萄 糖124 mmol·L－1）的15 mL離心管中搖勻，1 200 r·min－1離心10 min，取上清液，即為富含血小板的血漿（platelet rich plasma，PRP）。PRP在3 000 r·min－1下離心10 min，沉淀部分即為血小板，在血小板改良臺式液（無鈣）中洗兩次，用改良臺式液稀釋成適當(dāng)濃度，使其吸光度值在1左右，備用。

2.2 中性粒細(xì)胞的提取及缺氧模型的制備根據(jù)小鼠中性粒細(xì)胞提取試劑盒說明書對小鼠外周血中中性粒細(xì)胞進(jìn)行提取。取上述制備好的中性粒細(xì)胞，分別與生理鹽水、100μmol·L－1的丹酚酸A及10μmol·L－1的C3aR抑制劑于37℃孵育20 min后，置于缺氧小室中，通入混合氣（1%O2、5%CO2、94%N2），于37℃恒溫培養(yǎng)箱中缺氧處理4 h。在1 000 g下離心20 min，取上清液，即為缺氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化模型，其中常氧組為空白對照組。

2.3 比濁法檢測血小板聚集率取上述制備好的血小板，檢測20μmol·L－1ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率以及加入1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1SAA后的聚集率；檢測200 nmol·L－1過敏毒素C3a誘導(dǎo)的血小板聚集率以及加入SAA后的聚集率。用微孔法測血小板聚集率，使用酶標(biāo)儀檢測405 nm波長處樣品的OD值。

血小板聚集率＝（ODt＝0－ODt＝30）／ODt＝0×100%（30 min內(nèi)OD值的變化）。

2.4 免疫熒光技術(shù)檢測血小板在纖維蛋白原上的黏附準(zhǔn)備載玻片，包被50 mg·L－1纖維蛋白原溶液150μL，4℃孵育過夜，PBS洗滌。血小板與生理鹽水、不同濃度的SAA（1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1）及10μmol·L－1C3aR抑制劑于37℃孵育20 min，ADP誘導(dǎo)10 min，取血小板懸液150μL加到包被有纖維蛋白原的載玻片上，37℃孵育20 min，4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗3次，除去多余的多聚甲醛，采用鬼筆環(huán)肽對血小板避光標(biāo)記20 min，熒光顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取三個(gè)視野拍照，Image J軟件測量血小板面積。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測血小板膜蛋白CD62p和C3aR的表達(dá)取上述制備好的血小板，分別與生理鹽水、不同濃度的SAA（1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1）及10μmol·L－1C3aR抑制劑于37℃孵育20 min，加20μmol·L－1ADP于37℃孵育10 min，分別加入CD62p－APC和C3aR－FITC抗體，室溫避光孵育30 min，加入500μL 1%多聚甲醛，充分混勻，用流式細(xì)胞儀檢測血小板CD62p和C3aR的熒光強(qiáng)度。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測MPO、NE、LF及MMP9的水平嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書操作檢測MPO、NE、LF及MMP9的水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，方差齊組間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)；方差不齊組間兩兩比較采用Dunnett－T3檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的丹酚酸A抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、黏附和釋放利用ADP處理血小板構(gòu)建體外血小板活化模型，與生理鹽水組比較，經(jīng)ADP處理后血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附及CD62p表達(dá)顯著增高（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）；與ADP誘導(dǎo)組相比，不同濃度SAA處理組和阿司匹林陽性對照組血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附及CD62p表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。提示不同濃度的SAA可抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、黏附和釋放。見圖1。

圖1 不同濃度SAA對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集、黏附和釋放的影響

3.2 C3aR介導(dǎo)參與血小板聚集、黏附和釋放利用ADP處理血小板構(gòu)建體外血小板活化模型，與生理鹽水組比較，經(jīng)ADP處理后血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附和CD62p表達(dá)顯著增高（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）；與ADP誘導(dǎo)組比較，C3aR抑制劑處理組血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附及CD62p表達(dá)顯著降低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05）。提示C3aR參與機(jī)體血小板的活化過程。見圖2。

3.3 SAA抑制C3aR表達(dá)發(fā)揮抗血小板作用利用ADP處理血小板構(gòu)建體外血小板活化模型，與生理鹽水組比較，經(jīng)ADP處理后的血小板C3aR表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）；與ADP誘導(dǎo)組比較，不同濃度的SAA處理組血小板的C3aR表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。利用C3a處理血小板構(gòu)建體外血小板活化模型，與未處理組比較，經(jīng)C3a處理后的血小板聚集水平顯著增高（P＜0.05）；與C3a誘導(dǎo)組比較，不同濃度的SAA處理組血小板的聚集水平顯著降低（P＜0.05）。提示不同濃度的SAA抑制C3aR的表達(dá)發(fā)揮抗血小板作用。見圖3。

圖2 C3aR對ADP誘導(dǎo)大鼠血小板活化、聚集和黏附的影響

圖3 SAA抑制C3aR表達(dá)發(fā)揮抗血小板作用

3.4 SAA對缺氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒的抑制作用利用1%O2處理中性粒細(xì)胞構(gòu)建體外中性粒細(xì)胞活化模型，與常氧組比較，經(jīng)1%O2處理后中性粒細(xì)胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著增高（P＜0.05）；與缺氧誘導(dǎo)組比較，SAA處理組中性粒細(xì)胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

3.5 C3aR介導(dǎo)參與中性粒細(xì)胞脫顆粒利用1%O2處理中性粒細(xì)胞構(gòu)建體外中性粒細(xì)胞活化模型，與常氧組比較，經(jīng)1%O2處理后中性粒細(xì)胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著增高（P＜0.05）；與缺氧誘導(dǎo)組比較，C3aR抑制劑處理組中性粒細(xì)胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著降低（P＜0.05）。提示中性粒細(xì)胞活化可能與過敏毒素受體C3aR有關(guān)。見圖5。

圖4 SAA對缺氧誘導(dǎo)小鼠中性粒細(xì)胞脫顆粒的影響

圖5 C3aR對缺氧誘導(dǎo)小鼠中性粒細(xì)胞脫顆粒的影響

4 討論

血小板和中性粒細(xì)胞在維持血管和組織完整性方面起著至關(guān)重要的作用。血小板和巨核細(xì)胞通過胞外介質(zhì)和微粒與中性粒細(xì)胞相互作用，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的激活作用［12－17］。激活的中性粒細(xì)胞表達(dá)組織因子，與血小板相互作用時(shí)促進(jìn)免疫血栓形成［18－19］。血小板－中性粒細(xì)胞的相互作用對心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定有顯著影響，被認(rèn)為是治療心血管疾病的方向［20－21］。補(bǔ)體作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，激活后會放大和促進(jìn)中性粒細(xì)胞和血小板的激活［22］。本研究分別針對血小板激活和中性粒細(xì)胞脫顆粒對丹酚酸A的免疫調(diào)節(jié)進(jìn)行評價(jià)。ADP是體外導(dǎo)致血小板活化的常見誘因，缺氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)是中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，ADP導(dǎo)致血小板活化，并引起固有免疫反應(yīng)，缺氧導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化，發(fā)生脫顆粒反應(yīng)；而丹酚酸A預(yù)孵育可以抑制補(bǔ)體成分過敏毒素受體C3aR表達(dá)，從而抑制血小板活化和中性粒細(xì)胞脫顆粒，發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)。

血小板是巨核細(xì)胞釋放的無核細(xì)胞碎片，經(jīng)過一個(gè)多階段的細(xì)胞質(zhì)分裂過程，在數(shù)天內(nèi)將生物活性化合物濃縮成顆粒，以細(xì)長的前體形式釋放，這些前體經(jīng)歷多次反復(fù)裂變達(dá)到最終大?。?3］。血小板內(nèi)含有多種顆粒成分，在發(fā)揮止血功能時(shí)可以釋放生物活性介質(zhì)［24］，且在機(jī)體防御入侵病原體方面發(fā)揮重要作用。血小板在血管損傷時(shí)通過其表面免疫受體的表達(dá)和分泌炎癥調(diào)節(jié)因子、免疫調(diào)節(jié)因子，識別并控制侵入的病原體，釋放刺激物促進(jìn)組織修復(fù)，發(fā)揮免疫效應(yīng)［25－26］。血小板表面免疫受體C3aR屬于固有免疫系統(tǒng)中的補(bǔ)體系統(tǒng)，在感染或組織應(yīng)激時(shí)補(bǔ)體激活，產(chǎn)生一組具有不同生物學(xué)功能的效應(yīng)分子［27－28］，小片段C3a通過與其特定受體C3aR相互作用介導(dǎo)炎癥。雖然過敏性毒素受體C3aR通常與炎癥細(xì)胞相關(guān)，但體外研究表明它們也在血小板上表達(dá)［29］。血小板是具有高度免疫活性的細(xì)胞，通過補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，可以在血管炎癥過程中協(xié)調(diào)動脈粥樣硬化形成中的初始信號事件［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，C3aR抑制劑可以顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板活化；丹酚酸A不僅可顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板活化，還能下調(diào)C3aR的表達(dá)。推測丹酚酸A可通過調(diào)節(jié)C3aR的表達(dá)抑制血小板的活化，C3aR是調(diào)節(jié)血小板活化途徑的重要蛋白。

中性粒細(xì)胞構(gòu)成血液中最豐富的白細(xì)胞群體，對有害刺激的病原體進(jìn)行早期先天免疫反應(yīng)［31］。中性粒細(xì)胞表達(dá)大量的氧化酶和蛋白水解酶，這些酶預(yù)先形成并儲存在顆粒中。中性粒細(xì)胞損傷周圍組織的傾向與其激活狀態(tài)密切相關(guān)，增強(qiáng)脫顆粒和呼吸爆發(fā)活動的啟動是造成重大損害的先決條件。缺氧顯著上調(diào)了中性粒細(xì)胞主要顆粒的釋放，在一定程度上促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞損傷［32］。中性粒細(xì)胞在刺激后更容易受到C3a／C3aR的激活，發(fā)生脫顆粒反應(yīng)［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可引起中性粒細(xì)胞脫顆粒，增加NE、MPO、MMP9、LF的釋放；丹酚酸A可以顯著抑制中性粒細(xì)胞中NE、MPO、MMP9、LF的水平；而C3aR抑制劑可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒。推測丹酚酸A可通過調(diào)節(jié)C3aR的表達(dá)抑制中性粒細(xì)胞的活化。

綜上所述，丹酚酸A可能通過調(diào)控C3aR的表達(dá)抑制血小板聚集、黏附和釋放，防止中性粒細(xì)胞脫顆粒，從而預(yù)防和治療臨床缺血性疾病。