基于細(xì)胞自噬蛋白LC3、p62研究不同微粒的復(fù)方蜥蜴散對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用*

王藝臻，王佳林，朱西杰

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院，寧夏 銀川750004

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種結(jié)直腸的慢性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血等，病程遷延難愈，被世界衛(wèi)生組織列為疑難疾?。?－2］。細(xì)胞自噬具有防止病理產(chǎn)物積聚，處理細(xì)胞內(nèi)損傷蛋白、衰老細(xì)胞器的功能，而LC3、p62為細(xì)胞自噬的主要蛋白標(biāo)志物。本研究將基于自噬蛋白LC3、p62研究不同微粒的復(fù)方蜥蜴散對(duì)2，4，6－三硝基苯磺酸（2，4，6－trinitro－benzenesulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)UC模型大鼠的影響，為復(fù)方蜥蜴散尋找可能相關(guān)的細(xì)胞自噬靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥治療UC提供新思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠42只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（寧）2015－0001，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房，12 h／12 h的光照／黑夜循環(huán)，溫度（22±2）℃，濕度45%～50%，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑復(fù)方蜥蜴散（蜥蜴15 g，黃芪30 g，黨參15 g，山藥15 g，白術(shù)15 g，延胡索10 g，枳殼15 g，砂仁10 g，旋覆花10 g，佛手10 g，白芍15 g，烏梅10 g，半夏10 g）（寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院，批號(hào)：20180632）；柳氮磺吡啶（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：901553－1G）。LC3、p62、β－actin、山羊抗兔二抗抗體［柏奧易杰（北京）科技有限公司，批號(hào)分別為：bs－8878R、bs－2951R、BE0021、BE0101］；ECL發(fā)光液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：KGP1127）；蛋白marker（美國(guó)Thermo公司，貨號(hào)：26616）；Tris、PBS磷酸鹽緩沖液［范德（北京）生物科技有限責(zé)任公司，貨號(hào)分別為：SS1426、IH0132］；TNBS（美 國(guó)Sigma公 司，貨 號(hào)：IPVH00010）；PVDF膜（Millipore公 司，貨 號(hào)：IPVH00010）；TBST、BCA蛋白定量試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為：p25133、KGPBCA）；脫脂奶粉（美國(guó)BD公司，批號(hào)：0252038）；甘氨酸［范德（北京）生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：20180306］；SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液（凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：KGP101X）；甲醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200903）；SDS（日本W(wǎng)ako公司，貨號(hào)：CAH4859）；水合氯醛（天津大茂公司，批號(hào)：20201007）。

1.3 儀器BP310P型稱量天平（Sartorius公司）；centrifuge5417R型低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；MDF－U72V型超低溫冰箱（SANYO公司）；電泳儀（美國(guó)Bio－Rad公司）；RM2016型切片機(jī)（德國(guó)萊卡LEICA公司）；SI－0246型旋渦混合器（美國(guó)SI公司）；CKX41型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；XR型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司）。

2 方法

2.1 藥物制備不同微粒的復(fù)方蜥蜴散：復(fù)方中藥經(jīng)過(guò)粉碎、高溫滅菌后，蒸2.5 h，晾曬1周干燥后，分別過(guò)80目篩（復(fù)方蜥蜴散80目）和過(guò)100目篩（復(fù)方蜥蜴散100目），將80目篩和100目篩的不同微粒按照1∶1等量混合（復(fù)方蜥蜴散100＋80目），用雙蒸水煎煮濃縮后制成每毫升含0.15 g生藥的糊劑混懸液，經(jīng)高溫滅菌后，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥將36只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為6組，即空白組、模型組、柳氮磺吡啶（0.3 g·kg－1）組、復(fù)方蜥蜴散80目（1.5 g·kg－1）組、復(fù)方蜥蜴散100目（1.5 g·kg－1）組、復(fù)方蜥蜴散100＋80目（1.5 g·kg－1）組，每組7只。用石蠟油潤(rùn)滑的聚丙烯管（外徑2 mm）緩慢插入大鼠肛門上段8 cm結(jié)腸內(nèi)緩慢注入5%TNBS（0.1 g·kg－1）與50%乙醇的混合液0.25 mL灌腸復(fù)制UC模型，空白組用0.25 mL生理鹽水灌腸。造模結(jié)束后，除空白組外，各組隨機(jī)抽取1只大鼠，取結(jié)腸，進(jìn)行HE染色。若殺檢大鼠出現(xiàn)結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、充血水腫及潰瘍等病理變化，及大鼠出現(xiàn)大便次數(shù)增多、糞質(zhì)稀薄、黏液膿血便、食量減少、毛發(fā)晦暗無(wú)澤、消瘦拱背等則為大鼠UC模型復(fù)制成功。

造模成功后，各組灌服相應(yīng)的藥物，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥14 d，觀察大鼠的表觀指標(biāo)。

2.3 HE染色觀察大鼠結(jié)腸組織病理變化末次給藥后，大鼠禁食24 h，用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉。每組隨機(jī)選3只大鼠剖腹，取結(jié)腸，用40 ng·L－1甲醛固定。

脫蠟：用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟各10 min；入水：100%乙醇Ⅰ和Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min→自來(lái)水沖洗5 min→蘇木素染色10 min→自來(lái)水沖洗30 min→鹽酸乙醇分化15 s→自來(lái)水沖洗30 min→伊紅染色5～8 min→過(guò)水；脫水：70%乙醇1 min→80%乙醇1 min→90%乙醇5 min→95%乙醇5 min→100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各5 min；透化：二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10 min；中性樹(shù)脂封片；顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.4 Western Blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)末次給藥后每組隨機(jī)選3只大鼠，取結(jié)腸。提取結(jié)腸組織蛋白并測(cè)定其濃度后將樣品進(jìn)行變性，－80℃下分裝保存。

配制濃縮膠和分離膠后進(jìn)行電泳，電泳前進(jìn)行檢漏，加所需蛋白樣品并在最左側(cè)加入5μL的Maker，在200 V電壓下電泳30 min；將PVDF膜于甲醇中激活10 s，激活后的PVDF膜置于轉(zhuǎn)膜液中保存，切膠并放入轉(zhuǎn)膜液中，30 mA轉(zhuǎn)膜50 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于雙層塑料膜間，并滴加1 mL轉(zhuǎn)膜液，裁剪所需要的蛋白條帶，PBST浸洗3次，每次15 min，封閉1 h；然后滴加200μL一抗，4℃過(guò)夜，次日將條帶置于PBST中，沖洗3次，每次10 min，滴加500μL二抗，室溫孵育1 h后，將條帶置于PBST中，浸洗3次，每次10 min，進(jìn)行曝光，每個(gè)條帶滴加200μL的ECL發(fā)光液，暗室內(nèi)曝光、顯影保存圖像。用Image J軟件對(duì)蛋白條帶圖進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。假設(shè)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，取α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的表觀指標(biāo)模型組大鼠出現(xiàn)黏液膿血便、精神狀態(tài)萎靡、扎堆少動(dòng)、毛色晦暗；復(fù)方蜥蜴散80目組、復(fù)方蜥蜴散100＋80目組、復(fù)方蜥蜴散100目組、柳氮磺吡啶片組黏液膿血便逐漸消失、精神狀態(tài)佳、活躍、毛色光潔，以復(fù)方蜥蜴散100＋80目組為優(yōu)。

3.2 觀察結(jié)腸組織病理學(xué)空白組大鼠結(jié)腸黏膜表面光滑平整，大腸腺結(jié)構(gòu)完整清晰可見(jiàn)，細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組結(jié)腸黏膜表面大面積破損凸凹不平，有膿腫及潰瘍面形成，腺體萎縮，細(xì)胞形態(tài)改變，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，排列紊亂不規(guī)則；復(fù)方蜥蜴散100＋80目組和柳氮磺吡啶組結(jié)腸黏膜組織可見(jiàn)到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但明顯少于模型組；復(fù)方蜥蜴散80目組仍可見(jiàn)到浸潤(rùn)大量炎性細(xì)胞，甚至達(dá)到黏膜下層，腺體結(jié)構(gòu)不完整；復(fù)方蜥蜴散100目組無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腸黏膜病理學(xué)改變（HE，×200）

3.3 Western Blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織p62、LC3蛋白表達(dá)與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p62蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，LC3 II／LC3 I水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方蜥蜴散100＋80目、復(fù)方蜥蜴散100目、復(fù)方蜥蜴散80目及柳氮磺吡啶組均可明顯上調(diào)p62蛋白表達(dá)，降低LC3 II／LC3 I水平（P＜0.05），以復(fù)方蜥蜴散100＋80目組為優(yōu)。見(jiàn)圖2。

圖2 Western Blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織p62、LC3蛋白表達(dá)

4 討論

UC屬于中醫(yī)學(xué)“腸癖”“下利”“腹痛”等范疇，因飲食和情志內(nèi)傷，復(fù)感外邪導(dǎo)致脾胃升清降濁功能失常，氣機(jī)斡旋失司，濁毒積滯于腸道，腸絡(luò)損傷，黏膜在缺血缺氧狀態(tài)下自噬激活，失于傳化糟粕和津液，腸黏膜血敗肉腐，化膿成癰，內(nèi)成潰瘍而致本病發(fā)生［3－6］。正如《圣濟(jì)總錄·膿血痢》所言：“積熱蘊(yùn)結(jié)，血化為膿，膿血相雜，故成膿血痢”。朱西杰教授采用復(fù)方蜥蜴散治療UC，通降濁毒、化瘀解毒、促黏膜血行、扶正以修復(fù)創(chuàng)面［7－8］。

方中選用中藥如補(bǔ)中益氣的黃芪、山藥，可扶助正氣，黃芪和山藥中的主要活性物質(zhì)黃芪多糖和山藥多糖具有抗炎、調(diào)節(jié)自噬、改善氧化應(yīng)激、提高機(jī)體免疫力的作用［9－10］?！叭バ啊笔庆畛岸尽薄梆觥钡刃皻?，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》有云：“堅(jiān)者削之……結(jié)者散之，留者攻之”，為治療癌瘤的基本原則。故采用解毒散結(jié)的蜥蜴為君，并以軟堅(jiān)散結(jié)的生牡蠣，二者合用增強(qiáng)解毒散結(jié)之功；臣以半枝蓮、三七活血止痛，增強(qiáng)祛瘀生新之功效；酸收固澀的延胡索、海螵蛸合澀腸止瀉的烏梅與溫補(bǔ)的鹿角霜合用，共同發(fā)揮促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的作用。藥理研究發(fā)現(xiàn)，寧夏密點(diǎn)蜥蜴及牡蠣酶解產(chǎn)物可降低體內(nèi)炎癥因子水平，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性；延胡索、海螵蛸、鹿角霜可抗血小板聚集、抑制白細(xì)胞減少、促進(jìn)紅細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成，具有加速潰口愈合的功效，三藥合用共同修復(fù)損傷的黏膜組織［11－12］。有研究顯示，烏梅提取物通過(guò)降低NF－κB p65蛋白表達(dá)和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而減輕腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織中腸道水腫程度，以發(fā)揮預(yù)防潰瘍和減少贅生物形成的作用［13－20］。綜上，諸藥合用共奏扶正補(bǔ)氣血、解毒化瘀之功。葉天士在《臨證指南醫(yī)案》有云：“湯者蕩也，去大病用之；散者散也，去急病用之；丸者緩也，舒緩而治之也”。本復(fù)方在修復(fù)腸黏膜損傷中的給藥形式采用散劑以獲得較好療效，而散劑治療中顆粒的大小又是臨床療效的決定因素，故本研究選擇不同微粒的復(fù)方晰蜴散。

研究表明，LC3參與自噬形成到成熟的全部過(guò)程，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3 I被活化，結(jié)合磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3 II，通常以LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值判斷自噬水平的高低［21］。p62作為調(diào)控蛋白和泛素蛋白的聚集物作用中心，參與調(diào)控蛋白代謝及傳導(dǎo)多個(gè)信號(hào)通路，是隔離有害蛋白的泛素結(jié)合保護(hù)器［22－25］。已有研究顯示，p62與自噬標(biāo)志物蛋白LC3共定位可防止有害蛋白在體內(nèi)存積，二者免疫共沉淀參與細(xì)胞自噬的修飾與延伸，在自噬研究中起到積極作用［26－29］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方蜥蜴散100＋80目組為優(yōu)，能明顯降低大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中LC3 II／LC3 I水平，上調(diào)p62表達(dá)，其表達(dá)趨勢(shì)與復(fù)方蜥蜴散可解毒化瘀，促進(jìn)腸黏膜血液循環(huán)，修復(fù)受損腸黏膜，促進(jìn)腸道有害物質(zhì)向營(yíng)養(yǎng)及能量轉(zhuǎn)化，使?jié)儎?chuàng)面得以愈合相一致［30］。通過(guò)維持正常細(xì)胞自噬的作用，清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)，起到隔離有害蛋白，促進(jìn)黏膜修復(fù)，降低結(jié)腸炎癥反應(yīng)，緩解腸道平滑肌興奮痙攣的作用，為促進(jìn)結(jié)腸功能的恢復(fù)提供有利的環(huán)境。