富硒乳酸菌的篩選和體外活性的研究

韋夢(mèng)婷，王 英，單成俊，劉小莉，夏秀東，董明盛，周劍忠,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

硒元素是人體必需的微量元素[1]，具有抗癌、抗氧化、增強(qiáng)人體免疫力等重要的生理功能及廣泛的藥理作用[2]。硒元素不能在體內(nèi)自行合成，人體攝入硒的途徑主要來(lái)源于膳食[3]。

硒元素在自然界的存在形式有有機(jī)態(tài)和無(wú)機(jī)態(tài)，相較于常見(jiàn)的無(wú)機(jī)硒毒性大且機(jī)體不易吸收，有機(jī)硒或零價(jià)態(tài)的單質(zhì)硒往往具有較高的吸收利用率[4-5]。有研究表明，利用生物轉(zhuǎn)化法將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒是一條安全有效的途徑[6]，且轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒后，無(wú)機(jī)硒不僅毒性降低而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上效果更顯著，因此攝入有機(jī)硒被認(rèn)為是更安全的補(bǔ)充硒元素的方法[7-8]。

有機(jī)硒在地球上的分布極不均衡，人工合成有機(jī)硒難度高、消耗大，故很多研究者把目標(biāo)轉(zhuǎn)向微生物的富集作用。微生物繁殖快、易操作、轉(zhuǎn)化作用強(qiáng)等特點(diǎn)適于有機(jī)硒的合成。乳酸菌是一種人體常見(jiàn)益生菌，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，將其用于無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化，可在一定程度上保障富硒產(chǎn)品的安全性[9]。本文以15 株乳酸菌為材料，通過(guò)檢測(cè)對(duì)硒的耐受性和轉(zhuǎn)化能力篩選富硒菌，通過(guò)檢測(cè)菌體自由基清除率、還原力和菌體膽鹽及人工胃酸耐受力，確定富硒菌的體外生物活性大小，最終篩選出轉(zhuǎn)化活性高的乳酸菌，以期為富硒產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供原料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

15 株乳酸菌 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室自主分離得到，其中，菌株JX5、JX8、JX11 和JX14 分離自江西Kefir，菌株M9-4、6-9 和K15 分離自新疆酸馬奶，菌株SR3-8、SR1-6 分離自侗族酸肉，菌株AL2、B1-G2、XL3、AG2、G 和S 分離自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶；細(xì)菌DNA 提取試劑盒 上海生工生物工程有限公司；MRS培養(yǎng)基、牛膽鹽 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；亞硒酸鈉 分析純，天津市化學(xué)試劑研究所；3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3 乙基苯并噻唑啉（ABTS）分析純，上海麥克林生化試劑有限公司。

JY300C 電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；UV-1600PC 紫外分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；SW-CJ-1C 型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；124S-CW 分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TOMYSX500 自動(dòng)滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology 公司；FE28 pH 計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離鑒定 通過(guò)對(duì)15 株菌平板劃線法分離、接種到MRS 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)、革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)和鏡檢，初步鑒定為乳酸菌，為驗(yàn)證結(jié)果接下來(lái)進(jìn)行菌種的16S 鑒定。

將分離得到的15 株菌收集菌體凍干，經(jīng)液氮研磨后用細(xì)菌基因組DNA 試劑盒提取DNA，選用細(xì)菌通用引物27 F 和1492 R 對(duì)菌株的16S rDNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：上、下游引物1 μL(20 μmol/L)；模板DNA 1 μL；Premix Taq 25 μL；超純水22 μL。PCR 擴(kuò)增過(guò)程：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃后持續(xù)變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃ 2 min進(jìn)行35 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，將所得序列與NCBI 的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，確定菌種類型[10]。

1.2.2 菌種的活化 將甘油管保存的菌種在無(wú)菌條件下接種到MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃，24 h，活化2～3代后即可作為菌液使用。

1.2.3 富硒乳酸菌的篩選 將活化好的15 株乳酸菌菌液以3%的接種量接種到硒添加量（以亞硒酸鈉含量計(jì)）為20 μg/mL MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，測(cè)定菌液的OD600，3 次平行試驗(yàn)，去除OD 值顯著降低的菌株。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將初篩得到的富硒乳酸菌，3%的接種量接種到MRS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取一次樣，測(cè)定菌液的OD600，3 次平行試驗(yàn)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，以確定加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.5 適宜硒質(zhì)量濃度的確定 分別配制含亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為40、60、80、100、120 μg/mL 的MRS液體培養(yǎng)基，以3%的添加量接種富硒菌，37 ℃，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，觀察菌體顏色變化，確定最適加硒質(zhì)量濃度[11]。

1.2.6 硒含量測(cè)定 采用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）分光光度法檢測(cè)硒含量。由于在酸性條件下，硒與DAB 反應(yīng)生成黃色苤硒腦絡(luò)合物，苤硒腦絡(luò)合物在中性溶液中可被甲苯或二甲苯等有機(jī)溶劑較好地提取，在420 nm 時(shí)有最大吸光度[12-13]。

硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]，準(zhǔn)確吸取10 μg/mL 的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10 mL 分別加到100 mL 的燒杯中，加水至35 mL，再加入5 g/100 mL EDTA-2Na 溶液1 mL，搖勻，并用1:1的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至2～3，各加0.5% DAB 溶液4 mL，搖勻，置于暗處30 min，再用5% NaOH 調(diào)節(jié)pH 至中性，加入到分液漏斗中，加入10 mL 甲苯振搖2 min，靜置分層，去水層，收集甲苯層于比色皿中，于420 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將樣品離心取上清液10 mL，以下步驟按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出上清液硒含量，為殘留無(wú)機(jī)硒量，根據(jù)式1 計(jì)算富硒率[14]。

式中：E 為加入硒總量（μg）；Ei為殘留無(wú)機(jī)硒量（μg）。

1.2.7 富硒乳酸菌自由基清除率的檢測(cè) 將富硒菌在適宜硒質(zhì)量濃度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，再以3%的接種量接種到不含硒的新鮮MRS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至穩(wěn)定期（OD600值為2.10±0.02）。將菌液離心取上清，檢測(cè)上清液的生物活性，未加硒組做相同處理。

1.2.7.1 DPPH 自由基清除率的檢測(cè) 檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[15]，略作修改。將上清液用無(wú)菌水稀釋30 倍，取2 mL，加入2 mL 用無(wú)水乙醇溶解的0.2 mmol/L DPPH 溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，6000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)量波長(zhǎng)517 nm 下的吸光值，DPPH 自由基清除率計(jì)算方法見(jiàn)下式。

式中：Ai為離心的樣液的OD 值；Aj為無(wú)水乙醇和樣液等體積混合的OD 值；Ac為無(wú)水乙醇和等體積DPPH 混合的OD 值。

1.2.7.2 ABTS 自由基清除率的檢測(cè) 檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[16]，略作修改。將7 mmol/L ABTS 溶液與2.45 mmol/L 過(guò)硫酸鉀混勻，于4 ℃放置12～16 h以制備ABTS+·溶液。用無(wú)水乙醇將ABTS+·溶液稀釋直至其波長(zhǎng)在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02。將發(fā)酵上清液用無(wú)菌水稀釋20 倍；取2 mL，加入2 mL ABTS+·溶液，搖勻后于室溫下放置10 min，測(cè)量波長(zhǎng)734 nm 處的吸光值，計(jì)算樣品的自由基清除率[17]。

式中：A1為離心的樣液的OD 值；A2為無(wú)水乙醇和樣品的等體積混合液的OD 值；A0為無(wú)水乙醇和等體積ABTS+·溶液混合的OD 值。

1.2.8 富硒乳酸菌還原力的檢測(cè) 檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[18]，略作修改。將發(fā)酵上清液用無(wú)菌水稀釋5 倍，取1 mL 加入pH 6.6 的PBS 緩沖液1 mL 和1%的鐵氰化鉀1 mL，50 ℃水浴20 min，急速冷卻，再加入1 mL 的三氯乙酸，5000 r/min 離心5 min，取樣液1 mL，加入1 mL 蒸餾水和1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，靜置反應(yīng)10 min 后，測(cè)OD700，H2O 為空白。OD 值的大小與菌體的還原能力成正比。

1.2.9 富硒乳酸菌的膽鹽耐受性檢測(cè) 在MRS 培養(yǎng)基中加入0.0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的牛膽鹽，將富硒菌以3%的添加量接種，37 ℃，24 h，測(cè)定菌液的OD600，對(duì)照組做相同處理。

式中：N1為含膽鹽的培養(yǎng)基OD 值；N2為不含膽鹽的培養(yǎng)基OD 值。

1.2.10 富硒乳酸菌的人工胃液耐受性檢測(cè) 人工胃液的配制[19]：0.20% NaCl，0.35%胃蛋白酶，用1 mol/L的HCl 調(diào)整pH 至2.0，滅菌后備用。

以3%的接種量，在無(wú)菌條件下吸取不加硒的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期的乳酸菌菌液和在最適富硒濃度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期的菌液，8000 r/min，離心5 min，收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體1 次，加入預(yù)先配制好的人工胃液4.5 mL，立即充分搖勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0 和2 h 取適量菌液，采用MRS 稀釋涂布平板法，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)得活菌數(shù)，計(jì)算各菌株富硒前后在人工胃液中處理2 h 之后的存活率。

式中：N0：0 h 的活菌數(shù)(CFU/mL)；N2：2 h 的活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)，用SAS V8 分析顯著性差異，Origin 8.5 繪制圖表。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 菌株的16S 鑒定結(jié)果

將分離得到的15 株菌的測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST在GenBank 上核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)同源性，同源率98%以上的為有效結(jié)果。15 株菌均屬于乳酸菌，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株16s rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析Table 1 Phylogenetic analysis of 16s rDNA of strains

2.2 富硒乳酸菌的篩選

15 株乳酸菌在亞硒酸鈉添加量為20 μg/mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中菌體密度的變化情況見(jiàn)圖1。由圖可知，相較于未加硒的對(duì)照組，富硒組中菌株AG2、S 和JX11 的菌體OD 值顯著降低（P＜0.05），菌株SR3-8、B1-G2 和G 的OD 值極顯著降低（P＜0.01），其余9 菌株未見(jiàn)明顯變化，與楊靖鵬等[16]的乳酸菌耐硒實(shí)驗(yàn)中有5 株菌在10 μg/mL 的亞硒酸鈉質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中完全不生長(zhǎng)相比，本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株對(duì)低濃度的亞硒酸鈉具有較高的耐性，可繼續(xù)進(jìn)行富硒試驗(yàn)。篩選得出富硒菌有JX5、JX14、6-9、K15、AL2、JX8、XL3、M9-4、和SR1-6。

圖1 富硒乳酸菌的篩選Fig.1 Screening of Se-tolerant LAB

2.3 加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間的確定

生長(zhǎng)曲線可以確定適宜的加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間[20]，9 株富硒乳酸菌培養(yǎng)24 h 對(duì)應(yīng)的OD 值見(jiàn)圖2?？梢钥闯?，各菌株生長(zhǎng)速度略有不同，延滯期在2 h 內(nèi)，2 h 之后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，除了菌株SR1-6 對(duì)數(shù)期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在第20 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期之外，其余菌株均在16 h 到達(dá)穩(wěn)定期。由于菌株對(duì)數(shù)期繁殖速率最快，富硒能力強(qiáng)，有機(jī)硒及單質(zhì)硒轉(zhuǎn)化率高，所以在這個(gè)時(shí)期加入硒源有利于硒的富集，而加硒時(shí)間越早，對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝抑制作用越強(qiáng)，不利于硒的轉(zhuǎn)化[21,11]，因此把加硒時(shí)間定為對(duì)數(shù)前期。Suhajda等[14]研究酵母菌富硒時(shí)也曾發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)前期添加無(wú)機(jī)硒所得酵母的含硒量最高，并隨著細(xì)胞增殖，富硒能力增強(qiáng)，隨穩(wěn)定期接近而減弱。考慮到實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵效率，確定菌株JX5、JX14、6-9、K15、AL2、JX8、XL3、M9-4 和SR1-6 的加硒時(shí)間均為第2 h，JX5、JX14、6-9、K15、AL2、JX8、XL3、M9-4 的培養(yǎng)時(shí)間為16 h，SR1-6 的培養(yǎng)時(shí)間為20 h。

圖2 富硒乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Se-resistant LAB

2.4 培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)乳酸菌轉(zhuǎn)化硒的影響

培養(yǎng)基中添加不同含量亞硒酸鈉的富硒乳酸菌的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。由表可知，在亞硒酸鈉濃度在40 μg/mL 以上時(shí)，菌體均有不同程度的變紅，且變紅的程度隨著亞硒酸鈉的濃度增加而加深。研究表明，乳酸菌自身具有解毒作用，可將富集的硒一部分轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，而另一部分則可以被還原成零價(jià)態(tài)的單質(zhì)硒，單質(zhì)硒在溶液中呈紅色[12,22]。孫會(huì)輕等[23]對(duì)古尼蟲(chóng)草的富硒作用研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硒濃度大于7 μg/mL時(shí)，古尼蟲(chóng)草對(duì)硒的富集由生理性轉(zhuǎn)為病理性富集，且生物量和富硒率均極顯著下降。劉韞濤等[24]經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，當(dāng)硒濃度大于200 μg/mL 時(shí)，食用真菌對(duì)硒的富集就轉(zhuǎn)變成病理性富硒，說(shuō)明無(wú)機(jī)硒對(duì)真菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了毒性。實(shí)驗(yàn)中，菌體變紅則說(shuō)明有單質(zhì)硒轉(zhuǎn)化出來(lái)，同時(shí)伴隨有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化，且紅色越深單質(zhì)硒含量越高，相應(yīng)轉(zhuǎn)化出有機(jī)硒的含量就越少，因此需要在硒添加量和轉(zhuǎn)化量之間有所平衡，即選擇菌體顯示微紅色時(shí)為最適加硒濃度，此時(shí)的加硒量適中且單質(zhì)硒轉(zhuǎn)化量少，有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化量大，對(duì)菌體的傷害小。實(shí)驗(yàn)中所有菌株的最適亞硒酸鈉濃度均定為40 μg/mL。

表2 培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)菌體顏色變化的影響Table 2 Color changes of strains under different concentrations of sodium selenite culture

2.5 乳酸菌富硒率的研究

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作得出線性回歸方程Y=0.0302X-0.0108，決定系數(shù)R2=0.9889。

培養(yǎng)基硒含量為40 μg/mL 時(shí)，9 株富硒菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上清液中無(wú)機(jī)硒含量以及菌體富硒率如表3 所示。由表得知，菌株的富硒率各有不同，最高的是菌株JX5，達(dá)到81.80%，其次為AL2 和K15，富硒率為80.81%和80.23%，菌株JX14、6-9 和JX8 在70.00%～80.00%范圍內(nèi)，XL3、M9-4在50.00%～60.00%范圍內(nèi)，SR1-6 最低，為14.92%。6 株菌的富硒率都在70%以上，與朱和東等[25]研究的一株布氏乳桿菌的富硒率在56.52%相比，本文所使用的菌株具有較高的富硒能力。實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的菌株富硒率是往培養(yǎng)基中添加的硒含量（總硒量）減去上清液中殘留的無(wú)機(jī)硒含量所占總硒量的比值，實(shí)際上菌體在離心時(shí)并未將細(xì)胞膜上吸附的硒全部洗脫，還有少量殘留，因此上清液中測(cè)得的無(wú)機(jī)硒含量比實(shí)際含量要低，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的富硒率比實(shí)際富硒率高，實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果僅能極大限度地代表菌體實(shí)際富硒率。

表3 不同菌株的富硒率Table 3 Se enrichment rates of different strains

2.6 富硒乳酸菌體外活性的研究

研究表明，乳酸菌所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的含量不僅在不同菌株間有差異，在不同部位也有較大差異，清除自由基以及具有還原力的物質(zhì)主要釋放到細(xì)胞外，在上清液中含量較高[26-27]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇兩種較常見(jiàn)的DPPH、ABTS 自由基，檢測(cè)對(duì)照組和富硒組乳酸菌發(fā)酵上清液清除自由基能力和還原能力，旨在檢驗(yàn)富硒乳酸菌是否真正具有將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的能力。

2.6.1 富硒乳酸菌培養(yǎng)基上清液自由基清除率研究

2.6.1.1 富硒乳酸菌培養(yǎng)基上清液DPPH 自由基清除率 稀釋30 倍的培養(yǎng)基上清液對(duì)DPPH 自由基的清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，9 株菌中有5 株對(duì)DPPH 自由基清除率有顯著的升高（P＜0.05），其中菌株JX14、6-9、K15 和AL2 在富硒之后的清除率達(dá)到89%左右，JX5 為86.12%，比對(duì)照組提高了13.78%，在所有菌株中富硒之后清除率提升最大。清除率升高的原因可能是無(wú)機(jī)硒被乳酸菌轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，與蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合成硒蛋白和硒多糖釋放到胞外，Mao 等[28]研究了富硒蘑菇中硒蛋白和硒多糖的體外抗氧化活性，結(jié)果表明硒蛋白有良好的抗氧化能力，從而使得乳酸菌在富硒之后的DPPH 自由基清除率有所升高。

圖3 富硒乳酸菌培養(yǎng)基上清液DPPH 自由基清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rate of supernatant of Se-enriched LAB culture medium

2.6.1.2 富硒乳酸菌培養(yǎng)基上清液ABTS 自由基清除率 稀釋20 倍的培養(yǎng)基上清液對(duì)ABTS 自由基的清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。可以看出，各菌株的清除自由基能力各異，其中JX5、K15 和M9-4 清除率升高極顯著（P＜0.01），比對(duì)照組分別提高了10.49%、11.11%和10.80%，菌株AL2 和SR1-6 清除率有顯著提高（P＜0.05），有些菌株提高不顯著，可能因?yàn)椴煌陮?duì)自由基的親和力不同，表現(xiàn)為清除率大小不同。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)證明，有機(jī)硒對(duì)清除自由基具有十分重要的意義。

圖4 富硒乳酸菌培養(yǎng)基上清液ABTS 自由基清除率Fig.4 ABTS radical scavenging rate of supernatant of Se-enriched LAB culture medium

2.6.2 富硒乳酸菌培養(yǎng)上清液還原力研究 還原力可以判定該液體是否為優(yōu)良的電子供體，物質(zhì)的還原力與抗氧化力呈正相關(guān)[29]。9 株富硒乳酸菌還原力的大小如圖5 所示。相較于自由基清除率實(shí)驗(yàn)，乳酸菌富硒之后的還原力總體提升并不明顯，其中菌株JX5 上清液還原力極顯著增加（P＜0.01）、XL3 和M9-4 顯著增加（P＜0.05）。龐聰穎等[30]實(shí)驗(yàn)證明在添加富硒乳酸菌后小鼠血清膽固醇、三酰甘油含量均顯著降低，說(shuō)明富硒乳酸菌可以緩解由玉米赤霉烯酮導(dǎo)致的氧化損傷，富硒之后還原能力有一定的提高。

圖5 富硒乳酸菌培養(yǎng)基上清液還原力Fig.5 Reductive power of Se-enriched LAB culture medium supernatant

2.6.3 富硒乳酸菌膽鹽耐受力研究 乳酸菌等常用的益生菌是否能在體內(nèi)發(fā)揮作用主要在于能否忍受胃的高酸環(huán)境以及膽鹽耐受力的大小，因此為篩選益生菌，有些研究者已經(jīng)把膽鹽耐受力作為一項(xiàng)重要指標(biāo)[31-32]。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，菌株在膽鹽濃度為0.0%～0.3%的培養(yǎng)基中對(duì)照組和富硒組均生長(zhǎng)較好，濃度為0.4%時(shí)乳酸菌生長(zhǎng)尚好但OD 值差異明顯，可作為適宜濃度用來(lái)分析結(jié)果，如圖6 所示。9 株乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受力不同，相較于對(duì)照組，富硒組中菌株JX5 膽鹽耐受力極顯著增加（P＜0.01），JX14、6-9、K15、AL2 和XL3 顯著增加（P＜0.05）。乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能產(chǎn)生膽鹽水解酶，自身能夠耐受一定量的膽鹽[33]。膽鹽是由肝細(xì)胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而形成的鈉鹽或鉀鹽，研究表明，硒在人體內(nèi)通常以帶負(fù)電荷的形態(tài)存在，可以與帶正電荷的金屬離子結(jié)合，形成金屬-硒-蛋白質(zhì)復(fù)合物，最終把有害重金屬離子排出體外，起到解毒作用[34]。由此說(shuō)明乳酸菌在富硒之后對(duì)膽鹽的耐受力增強(qiáng)。

圖6 富硒乳酸菌膽鹽耐受力研究結(jié)果Fig.6 Tolerance of supernatant of Se-enriched LAB to bile salt

2.6.4 富硒乳酸菌人工胃液耐受力研究 將富硒前后的9 株菌進(jìn)行耐胃液實(shí)驗(yàn)，測(cè)定菌體2 h 之后的存活率，結(jié)果見(jiàn)圖7?？芍谖锤晃臈l件下，9 株乳酸菌有7 株的存活率大于1.00%，其中菌株JX5、6-9和M9-4 為11.24%、7.00%和5.21%；菌株SR1-6的存活率最低，僅有0.49%。經(jīng)富硒之后，菌株JX5 和M9-4 的存活率顯著增高（P＜0.05），分別增加至20.33%和8.16%，說(shuō)明該兩株菌在富硒之后耐酸性更強(qiáng)。

圖7 富硒乳酸菌人工胃液耐受力研究結(jié)果Fig.7 Tolerance of Se-enriched LAB to artificial gastric fluid

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從15 株乳酸菌中篩出9 株富硒菌，分別為植物乳桿菌6-9、AL2 和SR1-6；腸膜明串珠菌JX5、JX14 和JX8；干酪乳桿菌M9-4；乳酸乳球菌K15 和XL3。富硒率最高的是JX5，為81.80%，其次為AL2 和K15，富硒率為80.81%和80.23%，SR1-6 最低，為14.92%。通過(guò)對(duì)各菌株的自由基清除力、還原力和膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)得出，在富硒之后，菌株JX5、K15、AL2、XL3 和M9-4 在清除DPPH自由基方面相較于對(duì)照組有明顯升高；菌株JX5、K15、AL2、M9-4 和SR1-6 對(duì)ABTS 自由基的清除率有明顯升高；菌株JX5、XL3 和M9-4 的還原力有明顯升高；菌株JX5 和M9-4 的耐人工胃液性能增強(qiáng)；菌株JX5、JX14、6-9、K15、AL2 和XL3 的膽鹽耐受力增強(qiáng)，說(shuō)明乳酸菌具有一定的轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)硒為有機(jī)硒的能力。

利用乳酸菌的轉(zhuǎn)化力將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，并將有機(jī)硒提取出來(lái)，添加到食品、藥品中，可作為保健品或護(hù)膚品的原料，但是真正應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中依舊有很多問(wèn)題待解決。本文從富硒菌的篩選和體外活性檢測(cè)方面檢測(cè)乳酸菌的富硒性能，為富硒乳酸菌的篩選和后續(xù)研究提供一定的參考，具體的轉(zhuǎn)化機(jī)理和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索和闡述。