低氧和低氧誘導(dǎo)因子在月經(jīng)樣小鼠模型中對子宮內(nèi)膜崩解的作用

梁敏，陳西華，王樹芳，張欣，魯聰，武斌，南楠，張博男，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；4.山東大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院，濟南 250013)

月經(jīng)對女性生殖健康具有重要意義。月經(jīng)是指女性子宮在雌激素和孕激素的作用下，周期性發(fā)生內(nèi)膜增厚、血管和腺體增生、崩解出血以及修復(fù)的生理過程。子宮低氧狀態(tài)可以通過子宮內(nèi)膜血流減少、血氧分壓降低，或檢測到低氧標(biāo)志物——派諾硝唑等判定[1-3]。目前，對于月經(jīng)期間子宮組織是否存在低氧狀態(tài)一直存有爭議。Markee[4]構(gòu)建了經(jīng)典的月經(jīng)模型，他們將人類子宮內(nèi)膜移植到恒河猴眼內(nèi)并發(fā)現(xiàn)，在月經(jīng)開始(即血液釋放)之前，可以在4～24 h觀察到螺旋小動脈血管收縮，24 h后螺旋小動脈血管發(fā)生劇烈收縮導(dǎo)致子宮內(nèi)膜組織處于低氧狀態(tài)并造成子宮內(nèi)膜組織壞死。此外，我們的既往研究發(fā)現(xiàn)，與低氧相關(guān)的關(guān)鍵因素——低氧誘導(dǎo)因子1A(Hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A)在月經(jīng)樣小鼠子宮內(nèi)膜崩解時表達(dá)升高并激活下游基因[5]。在人類子宮內(nèi)膜中，HIF1A在月經(jīng)期的子宮內(nèi)膜細(xì)胞核中表達(dá)量最高[1，6]。Maybin等[7]最近的研究發(fā)現(xiàn)，月經(jīng)期間月經(jīng)大出血女性的的子宮內(nèi)膜中HIF1A表達(dá)量低于正常女性。在小鼠月經(jīng)樣模型中，高氧(75% O2)、HIF1A抑制劑或基因誘導(dǎo)引起的HIF1A降低均能延緩子宮內(nèi)膜修復(fù)，而正常水平的HIF1A則促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)過程，這項工作證實低氧和HIF1A在正常子宮內(nèi)膜修復(fù)中的重要性[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠生理性月經(jīng)模型P4撤退后2 d子宮組織派諾硝唑染色呈陽性[3]，并在P4撤退后8 h和24 h時發(fā)現(xiàn)，蛻膜化細(xì)胞與子宮內(nèi)膜分界處可見強烈低氧狀態(tài)[9]，以上結(jié)果揭示了小鼠子宮內(nèi)膜存在生理性低氧狀態(tài)。然而，也有研究認(rèn)為月經(jīng)期間子宮組織不存在低氧狀態(tài)。有研究通過監(jiān)測人子宮內(nèi)膜溫度和氙-133 清除率發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜的血流在月經(jīng)前或月經(jīng)期間均未減少[1]。Gannon等[2]利用電子順磁共振血氧測定技術(shù)和組織氧分壓檢測系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)，移植的人子宮內(nèi)膜由于停止給予孕酮(P4)激素(又稱P4撤退)而崩解，但沒有檢測到顯著的氧分壓改變，只在少數(shù)移植的子宮內(nèi)膜中檢測到派諾硝唑。

小鼠月經(jīng)模型建立于1984年[10]，2003年小鼠月經(jīng)樣模型又有了進(jìn)一步的優(yōu)化[9]。2007年Xu等[11]成功建立了基于P4藥理撤退的小鼠月經(jīng)樣模型。Finn等[10]切除小鼠卵巢后，通過周期性皮下注射E2和P4，隨后向?qū)m腔內(nèi)注射花生油來誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜蛻膜化，在P4撤退后小鼠的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)了類似高等靈長類雌性的經(jīng)期崩解出血現(xiàn)象。小鼠月經(jīng)樣模型可以實時研究子宮內(nèi)膜崩解，并允許體內(nèi)干擾的存在。因此，本研究將利用小鼠月經(jīng)樣模型進(jìn)一步探索低氧和HIF1A在子宮內(nèi)膜崩解中的作用。

材料和方法

一、實驗動物

8～10周齡的SPF Ⅱ級C57BL雌性小鼠49只，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，實驗動物許可證：SCXK(京)2019-0014。飼養(yǎng)條件：給予充足的水和食物飼養(yǎng)，保持明暗交替各12 h，溫度(21±1)℃，濕度50%～60%。所有動物實驗及手術(shù)操作均獲國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。

二、實驗試劑及儀器

E2(Alfa Aesar，美國)，P4(Sigma-Aldrich，美國)，二氯化鈷(CoCl2)(UN3077，上海國藥)，低氧探針試劑盒(HP3-100，Burlington，美國)，兔抗HIF1A單抗(NB100-134，Novus，美國)，蘇木素伊紅染液、山羊抗兔增強二步法檢測試劑盒(PV6100，北京中杉金橋)，核蛋白提取試劑盒(Thermo，美國)，β-Actin一抗(北京科溫生物)，Lamin-B 一抗(SC-20682，Santa，美國)，增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(北京全式金生物)；凝膠成像系統(tǒng)(Minichemo 500TM，北京賽智)，光學(xué)顯微鏡(XS-23C，上海蒲柘光電)。

三、研究方法

1.小鼠月經(jīng)樣模型的建立：根據(jù)以往的研究建立小鼠生理性P4撤退月經(jīng)樣模型[9-11]。對小鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，休養(yǎng)2周后記為第1天，第1～3天9：30在小鼠背部皮下注射100 ng E2；第4～6天，小鼠不做處理，正常飼養(yǎng)；第7天9：30在小鼠背部皮下注射50 ng P4和 5 ng E2后在小鼠背部皮下植入含有P4的硅膠管(P4維持)[12]；第8～9天9：30在小鼠背部皮下注射5 ng E2；第9天11：30打開小鼠背部，經(jīng)雙側(cè)子宮角向?qū)m腔內(nèi)注射15 μl無菌花生油以誘導(dǎo)子宮蛻膜化；在子宮蛻膜化49 h后，移除P4硅膠管(P4撤退，記為取材0 h)。分別在0 h、8 h、12 h、16 h、24 h時處死小鼠并收集子宮，雙側(cè)子宮組織用4%多聚甲醛固定或于-80℃冰凍儲存待用。

3.低氧探針檢測：小鼠處死前30 min經(jīng)腹腔給予低氧探針 60 mg·kg-1，并根據(jù)說明書對低氧探針進(jìn)行免疫組化分析。隨機選擇P4撤退后不同時間點各組小鼠各3只的3張不同切片，隨機拍攝5個視野(非重疊視野，不含肌層)，采用圖像處理程序Image J(https：//imagej.nih.gov/ij/)，計算各顯微圖像中 3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的染色面積比例。

4.免疫組化檢測HIF1A蛋白：取出固定好的子宮組織切片脫蠟、復(fù)水，在95℃、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中浸泡20 min以修復(fù)抗原，切片在3%的H2O2中浸泡15 min，核蛋白HIF1A單抗以1∶500稀釋并在4℃下孵育過夜，洗滌之后用山羊抗兔增強二步法檢測試劑盒室溫孵育1 h，然后用DAB室溫孵育1 min。每張切片隨機拍攝5個視野(無重疊視野，無肌層)，分別對每個視野的細(xì)胞數(shù)和HIF1A核染色的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

5.Western Blot檢測：用核蛋白提取試劑盒分別提取小鼠子宮冰凍樣本的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白，并加入適量蛋白酶抑制劑。單組蛋白的總量為15 μg，在4%～12% SDS-PAGE內(nèi)進(jìn)行凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后，在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h；隨后用HIF1A單抗以1∶500稀釋，β-Actin、Lamin-B 抗體分別以1∶2 000稀釋為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)參，室溫孵育3 h；用HRP標(biāo)記的小鼠抗兔IgG抗體以 1∶10 000稀釋與之雜交；然后用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒檢測。

6.石蠟組織切片 HE染色：小鼠子宮組織在4%多聚甲醛固定72 h，制作常規(guī)石蠟切片。脫蠟后經(jīng)梯度乙醇溶液水化，分別于蘇木精染料室溫染色1 min、1%鹽酸乙醇溶液分化1 s、1%氨水乙醇溶液返藍(lán)20 s、1%伊紅染液復(fù)染2 min(每步染色操作后均用清水沖洗3次)。梯度脫水后用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)分析采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、月經(jīng)樣小鼠子宮崩解過程中低氧與HIF1A的相關(guān)性

月經(jīng)樣小鼠P4撤退0 h 時，低氧探針定位于小鼠子宮腔上皮細(xì)胞、上皮下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞著床側(cè)的一小片區(qū)域，HIF1A主要位于大部分蛻膜區(qū)域的胞質(zhì)內(nèi)，但在上皮下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核中也有HIF1A表達(dá)；月經(jīng)樣小鼠P4撤退8 h 時，低氧探針出現(xiàn)在整個蛻膜區(qū)，并不局限于上皮下區(qū)域，HIF1A在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)增多，在細(xì)胞核中也有表達(dá)，尤其在管腔上皮細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最多；月經(jīng)樣小鼠P4撤退12 h 時，低氧探針集中在完好的蛻膜組織與著床側(cè)、壞死區(qū)外緣的交界處，蛻膜組織中HIF1A的表達(dá)位置與低氧探針一致；月經(jīng)樣小鼠P4撤退16 h 時，低氧探針集中在壞死區(qū)外緣，此時HIF1A的定位與低氧區(qū)相似，定位于多個細(xì)胞核；月經(jīng)樣小鼠P4撤退24 h時，低氧探針染色減少，僅在破裂區(qū)邊緣和上皮細(xì)胞可見，在低氧區(qū)交界處的可見少量核染色細(xì)胞。免疫組化半定量結(jié)果顯示，月經(jīng)樣小鼠P4撤退后12 h和16 h時小鼠子宮組織低氧探針染色面積百分比和HIFA的表達(dá)水平均顯著高于 P4撤退0 h時(P<0.05)(圖1、2)。

A：P4撤退后不同時間點低氧探針染色結(jié)果(免疫組化染色 ×100)；B：P4撤退后不同時間點低氧探針染色面積百分比。與0 h比較，**P<0.01圖1 P4撤退后不同時間點月經(jīng)樣小鼠子宮組織的低氧探針染色情況

A：P4撤退后不同時間點HIF1A染色情況(第一行圖片為免疫組化染色 ×100，第二行圖片免疫組化染色 ×400)，箭頭為HIF1A核染色細(xì)胞；B：P4撤退后不同時間點HIF1A核染色細(xì)胞百分比。與0 h比較，*P<0.05圖2 P4撤退后不同時間點月經(jīng)樣小鼠子宮組織HIF1A的表達(dá)情況

二、月經(jīng)小鼠崩解過程與低氧的關(guān)系

三、各組小鼠子宮組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中HIF1A的表達(dá)情況

A：子宮大體形態(tài)結(jié)果；B：小鼠子宮形態(tài)(HE染色 ×100)C：小鼠子宮形態(tài)(HE染色 ×400)圖3 P4撤退后24 h各月經(jīng)樣小鼠組的子宮大體和子宮組織形態(tài)結(jié)果

A：小鼠子宮組織低氧探針免疫組化染色；B：低氧探針染色面積百分比；C：小鼠子宮組織HIF1A免疫組化染色；D：HIF1A核染色細(xì)胞百分比。與組比較，*P<0.05圖4 月經(jīng)樣小鼠注射CoCl2模擬低氧的效果

A：Western Blot檢測細(xì)胞質(zhì)中HIF1A的表達(dá)；B：Western Blot檢測細(xì)胞核中HIF1A的表達(dá)；C：細(xì)胞質(zhì)中HIF1A表達(dá)灰度分析；D：細(xì)胞核中HIF1A表達(dá)灰度分析。與組比較，*P<0.05圖5 各組月經(jīng)樣小鼠子宮組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核HIF1A的表達(dá)情況

討 論

本研究以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ)，不僅證實了小鼠子宮在子宮內(nèi)膜崩解中存在低氧狀態(tài)，并進(jìn)一步闡明了P4撤退、低氧和HIF1A在小鼠子宮內(nèi)膜崩解中的作用。結(jié)果顯示，P4撤退后子宮組織低氧區(qū)域從腔上皮細(xì)胞逐漸擴展到整個蛻膜區(qū)，并在P4撤退后12 h和16 h時低氧強度增加，提示低氧與子宮內(nèi)膜崩解有關(guān)。另外，HIF1A在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)位置與低氧區(qū)域一致，特別是在P4撤退后12 h時，HIF1A的免疫組化染色區(qū)域與低氧探針染色區(qū)域高度重合。P4撤退后不同時間點的低氧變化情況，以及HIF1A核染色細(xì)胞百分比和分布情況與低氧的相關(guān)性，提示在子宮內(nèi)膜崩解時低氧激活了HIF1A蛋白。

既往月經(jīng)樣模型相關(guān)研究顯示，月經(jīng)樣小鼠子宮內(nèi)膜在P4撤退后8 h內(nèi)保持完整，24 h內(nèi)子宮內(nèi)膜達(dá)到完全崩解[12，14-15]。在P4撤退后12 h時回補P4可以抑制子宮內(nèi)膜崩解，由此推斷P4撤退后12 h為P4撤退的關(guān)鍵時期[16-17]。根據(jù)之前的研究，我們判定月經(jīng)樣小鼠子宮內(nèi)膜崩解的時期為0～24 h[14-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在P4撤退后0 h、4 h、8 h和24 h可以觀察到月經(jīng)樣小鼠子宮存在低氧狀態(tài)[5，18]。Maybin等[6-7]支持月經(jīng)期間子宮存在低氧的論斷，并認(rèn)為HIF1A可能是一種有效的、非激素性治療月經(jīng)大量出血的方法，提示HIF1A在月經(jīng)異常出血中的重要性。

本研究以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ)，通過更精細(xì)的時間進(jìn)程(包括P4撤退后12 h和16 h)，揭示了蛻膜化的子宮內(nèi)膜存在低氧狀態(tài)，低氧區(qū)域和P4撤退后激活的HIF1A定位有很強的相關(guān)性。在月經(jīng)樣小鼠模型中使用CoCl2模擬低氧狀態(tài)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜崩解是由P4撤退引起的，而不是由CoCl2模擬低氧引起的，即低氧參與子宮內(nèi)膜崩解但不是必要因素。