超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜定量檢測蜂毒衍生品中蜂毒肽的含量

蔡冬梅 傅 怡 張玉豪 孫菲菲 周金慧 楊宇暉 楊術(shù)鵬， 李 熠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京100093；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥230036；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的毒液，它是蜜蜂蜇刺敵害時釋放的一種生物武器。蜂毒中含有豐富的酶、多肽、生物胺、激素、有機酸、氨基酸等物質(zhì)，其中蜂毒肽（蜂毒溶血肽）是蜂毒中主要成分，占蜂毒干重的50%以上[1]。蜂毒肽是由24個氨基酸組成的小肽類物質(zhì)，其氨基酸序列為GIGAVLKVLTTGLPALI SWIKRKRQQ，其中6個親水性氨基酸殘基在C端，20個疏水性氨基酸殘基在N端，呈α－螺旋構(gòu)象[2]。蜂毒肽具有廣泛且強烈的生物學(xué)活性，如抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等功效[3～6]。目前，我國和全球多個國家均已批準蜂毒肽作為上市藥物，用于治療風(fēng)濕性疾病和周圍神經(jīng)炎。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽在皮膚保養(yǎng)和皮膚病防治方面療效確切，它能刺激肌膚膠原蛋白產(chǎn)生，撫平細紋，恢復(fù)彈性，從而使得蜂毒肽成為護膚品行業(yè)的新寵[7]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有眾多企業(yè)開展了蜂毒肽在護膚品中應(yīng)用探索，并在市場上推出了各式各樣的護膚產(chǎn)品，如蜂毒保濕水、蜂毒護膚霜、蜂毒面膜等。蜂毒產(chǎn)量非常稀少，從而導(dǎo)致蜂毒肽原料價格非常昂貴。護膚品中添加蜂毒肽會顯著增加生產(chǎn)成本，其價格顯著高于普通護膚品。當前，我國并未頒布有關(guān)護膚品等產(chǎn)品中蜂毒肽的含量測定標準，不同企業(yè)的生產(chǎn)方式和質(zhì)控標準并不統(tǒng)一，從而導(dǎo)致市場上蜂毒肽類護膚品的質(zhì)量參差不齊，甚至出現(xiàn)了假冒偽劣的現(xiàn)象。因此，對蜂毒肽的準確定量分析方法的開發(fā)已經(jīng)成為養(yǎng)蜂業(yè)和護膚行業(yè)的共識。但由于蜂毒肽眾多衍生產(chǎn)品中蜂毒肽含量很低，僅處于痕量水平，而其基質(zhì)又十分復(fù)雜，亟需開發(fā)一個可精確定量蜂毒肽含量的方法。

有關(guān)蜂毒肽的檢測方法主要是免疫分析和儀器分析。抗原抗體特異性識別是免疫分析方法的基礎(chǔ)，KING等[8]通過免疫小鼠，獲得蜂毒肽的多克隆抗體和單克隆抗體。但是作者并未基于獲得抗體開展定量分析方法開發(fā)。盡管免疫分析方法具有簡單、方便等優(yōu)點，但是由于抗體存在制備周期長、定量方法結(jié)果準確度和穩(wěn)定性差等弊端，限制了其在蜂毒肽定量中的應(yīng)用?；谏V的儀器分析在蜂毒肽定量分析方面有廣泛報道，也是當前蜂毒肽定量的主要檢測方法。早期報道的儀器分析方法主要基于高效液相色譜結(jié)合紫外檢測器（HPLC－UV），但是這類方法存在定量限高、準確度和精密度有限以及抗干擾能力差等弊端[9]。隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS）技術(shù)的成熟與普及，LC－MS已經(jīng)成為近10年來蜂毒肽的主要檢測方法。液相串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（LC－MS/MS）、液相串聯(lián)離子阱質(zhì)譜（LC－IT）以及液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜（LC－HRMS）也相繼應(yīng)用到各種基質(zhì)中蜂毒肽的定量[10～14]。由于蜂毒肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有24個氨基酸，采用LCMS檢測時，其離子化效率有限，從而導(dǎo)致建立方法的靈敏度依然有限[12～13]。此外，已報道的LCMS方法主要采用外標法進行定量分析，難以適用于眾多的蜂毒衍生品中蜂毒肽的準確定量[10～11，13]。近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和肽段合成技術(shù)的快速發(fā)展，基于LC－MS的靶向蛋白質(zhì)定量技術(shù)取得了巨大突破。與直接檢測小肽相比，基于蛋白酶水解策略結(jié)合同位素標記特征性肽段的定量技術(shù)在方法的靈敏度、準確度、穩(wěn)定性和方法實用性等方面具有顯著優(yōu)勢。本研究擬采用該策略并結(jié)合UHPLCHRMS開展蜂毒衍生品中蜂毒肽的定量分析方法開發(fā)和有效性評價，為保護蜂毒肽消費者的權(quán)利提供方法支持，同時為后續(xù)蜂毒肽行業(yè)標準的制定提供方法參考。

一、材料與方法

（一）儀器與試劑

1.儀器與設(shè)備。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿/高分辨靜電軌道阱質(zhì)譜（UHPLC Q Executive Plus，美國Thermo Fisher Scientific公司）；臺式低溫離心機（Microfuge 22R Centrifuge，美國Beckman Coulter公司）；全波長酶標儀（Multiskan GO，美國Thermo Fisher Scientific公司）；電子分析天平（PL203，德國Mettlertoledo公司）；蒸發(fā)濃縮儀（Speed－Vacsvstem，RVC2－18， 德國MarinChrist公司）；超純水機（Milli－Q，美國Millipore公司）；超低溫冰箱（MDF－U3286S，日本SANYO公司）。

2.試劑與標準品。碳酸氫銨（NH4HCO3）購買于Solarbio公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、 二硫蘇糖醇（DL－dithiothreitol，DTT）、 碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA） 購于Sigma－Aldrich公司； 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）購于J.T.Baker公司；質(zhì)譜級胰蛋白酶（trypsin） 購 自Promega（Madison，WI，USA） 公 司 ，甲酸（formic acid，F(xiàn)A）、 甲醇（methanol）、 乙腈（acetonitrile，ACN）購買于Fisher公司；C18除鹽洗脫柱購于3M公司（Minnesota Mining and Manufacturing）。

特征肽段VLTTGLPALISWIK；穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標（SIL－IS）肽段VLTTGLPALISWIK*（K*表示賴氨酸中的碳置換為13C，氮置換為15N）由南京源肽生物科技有限公司合成，純度≥98%，儲存在－20℃?zhèn)溆谩?/p>

（二）樣本前處理方法

1.溶液配制。40 mM NH4HCO3溶液：稱取0.316 g NH4HCO3，用超純水定容100 mL，4℃冰箱保存待用。100 mM DTT：稱取DTT 308.5 mg，40 mMNH4HCO3溶液定容到20 mL，每管l mL分裝，－20℃冰箱保存待用。100 mM IAA溶液：稱取IAA 0.39 g，用40 mM的NH4HCO3溶液定容至20 mL，－20℃冰箱保存待用?；罨海?00μL ACN、3μL TFA，超純水定容至1 mL，4℃保存。平衡液：1μL TFA，超純水定容至1 mL，存于4℃。洗脫液：800μL ACN、1μL TFA，超純水定容至1 mL，4℃保存。

2.樣本前處理方法。

（1）方法A：未酶切前處理方法。準確稱取蜂毒衍生品樣品1 g至10 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋溶解后，35℃氮吹至近干。加入1 mL去離子水渦旋復(fù)溶，于14 000 rpm 4℃條件下離心12 min。收集上清液于新的2 mL離心管中。向每個樣品中加入200 ng/mL IS肽段進行質(zhì)譜分析。（2）方法B：酶切前處理方法。準確稱取蜂毒衍生品樣品1 g至10 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋溶解后，35℃氮吹至近干。加入1 mL去離子水渦旋復(fù)溶，于14 000 rpm4℃條件下離心12 min。收集上清液于新的2 mL離心管中。移取蛋白質(zhì)溶液200μL與800μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100μL 30 mMDTT溶液，在室溫下反應(yīng)60 min，然后再加入500μL 100 mMIAA溶液于室溫下暗反應(yīng)60 min。樣品中加入30μL胰蛋白酶溶液，于37℃過夜酶切12 h。酶切反應(yīng)完成后，加入1μL甲酸使胰蛋白酶失活，終止酶切反應(yīng)，向每個樣品中加入200 ng/mL IS肽段?；旌暇鶆蚝笫褂肅18柱除鹽，將除鹽后的肽段干燥，用100μL初始流動相復(fù)溶進入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

（三）儀器方法

1.色譜條件。色譜柱為Thermo Hypersil GOLDTMC18（2.1 mm×100 mm，1.9μm）； 流動相組成：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫條件為：0～1.0 min，5%流動相B；1.0～2.0 min，5%～15%流動相B；2.0～12.0 min，15%～40%流動相B；12.0～14.0 min，40%～95%流動相B；14.0～16.5 min，95%流動相B；16.5～17.5 min，95%～5%流動相B；17.5～20.0 min，5%流動相B。流速為0.30 mL/min；進樣量為5.0μL；柱溫為40℃。

2.質(zhì)譜條件。離子源參數(shù)：鞘氣的流速為38 arb；輔助氣的流速為15 arb；擋錐氣的流速為0 arb；電噴霧電壓3.2 kV；離子導(dǎo)管的溫度275℃；S-lens RF level設(shè)為60；離子源溫度380℃；采集的模式為正離子模式下的Full MS－ddMS2；其中Full MS的具體參數(shù)設(shè)置為：分辨率為70 000；AGC Target為3e6；最大離子注入時間為200 ms；質(zhì)量掃描范圍為300～1 200 Da；數(shù)據(jù)類型為棒狀圖；dd-MS2的具體參數(shù)設(shè)置為：分辨率為17 500；AGC Target為1.6e5；最大離子注入時間為120 ms；Loop count為2；隔離窗口為2.0 Da；NCE為35；數(shù)據(jù)類型為棒狀圖；dd settings中，最小AGC為8.0e3；頂點觸發(fā)為2～6 s；同位素排除為on；動態(tài)排除為8.0 s。

表1 蜂毒肽特征肽段及同位素內(nèi)標肽段的質(zhì)譜分析參數(shù)

（四）方法學(xué)驗證

1.特異性。在蜂毒肽樣品中和空白樣品中提取篩選好的蜂毒肽特征肽段，觀察目標肽段的色譜峰的信噪比，明確空白樣本中是否存在干擾峰。

2.線性范圍。采用內(nèi)標法定量，使用初始流動相分別配制特征肽段的同位素內(nèi)標標準曲線，設(shè)置特征肽段濃度點分別為3、6、15、50、150、500 ng/mL，其中每個濃度點的標準溶液中都含50 ng/mL特征肽段對應(yīng)的同位素內(nèi)標肽段標品。準備好樣本由UHPLC－HRMS進行分析。

3.檢測限、定量限。不含蜂毒肽的空白樣品按照前處理方法操作后分析，將目標色譜峰的信噪比≥3時的濃度，設(shè)定為檢測限（LOD）；同時將信噪比≥10時的濃度設(shè)定為定量限（LOQ）。

4.準確度和精密度。本試驗選擇特征肽段低（LOQ）、中（2LOQ）、高（10LOQ）3個濃度水平進行回收率和精密度試驗。按前處理方法操作后分析，每個濃度重復(fù)6份，連續(xù)做3 d，計算日內(nèi)精密度及日間精密度，得到的結(jié)果作為整個試驗方法的準確度和精密度。

二、結(jié)果與分析

（一）蜂毒肽特征肽段的篩選與確立特異性肽段的選擇是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量靶向蛋白質(zhì)方法開發(fā)的關(guān)鍵和難點，直接決定了后續(xù)建立方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。選擇特征肽段時應(yīng)遵循的基本原則是，肽段中氨基酸數(shù)目以8～20為宜，不應(yīng)過短或者過長；且為質(zhì)譜和液相友好型；選擇的肽段應(yīng)具備特異性、穩(wěn)定性和一定離子豐度的專屬性肽段，需通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的比對；肽段中應(yīng)當避免含有易于修飾的氨基酸，如天冬酰胺（N）、 谷氨酸（E）、 天冬氨酸（D）、 絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、半胱氨酸（C）等；肽段中應(yīng)避免含有胰蛋白酶漏切的位點（K或R）。通過與NCBI及UniProt數(shù)據(jù)庫比對，蜂毒肽水解之后的肽段VLTTGLPALISWIK具有唯一性，且在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上具有較好的相應(yīng)值。蜂毒肽水解之后另外一條肽段GIGAVLK在搜庫匹配時，不具備唯一性，且在質(zhì)譜中響應(yīng)較低。因此，本研究將VLTTGLPALISWIK作為蜂毒肽的特征肽段開展液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的定量分析方法開發(fā)。

（二）檢測方法的靈敏度、線性范圍、準確度與精密度

1.選擇性。樣本經(jīng)提取、酶解、凈化、濃縮等前處理步驟之后，由UHPLC－HRMS進樣分析。蜂毒肽酶解之后的特征性肽段VLTTGLPALISWIK為儀器檢測的靶向物質(zhì)，其精確質(zhì)量數(shù)為m/z756.463 43（[M+2H]2+）， 其允許偏差應(yīng)在5×10－6以內(nèi)。該肽段的MS/MS圖譜（子離子圖譜）中含有豐度較高的碎片離子m/z927.564 09、585.359 38，兩者的精確質(zhì)量數(shù)誤差應(yīng)當＜10×10－6。用于定量的穩(wěn)定同位素內(nèi)標肽段VLTTGLPALISWIK*的m/z761.478 35（[M+2H]2+）， 其允許偏差也在5×10－6以內(nèi)。其MS/MS圖譜（子離子圖譜）中應(yīng)該含有蜂毒肽的肽段VLTTGLPALISWIK的特異性碎片離子m/z927.564 09、585.359 38；相應(yīng)的，穩(wěn)定同位素內(nèi)標肽段的特征肽段VLTTGLPALISWIK*的子離子圖譜（MS/MS）中應(yīng)含有碎片離子m/z935.604 06和m/z593.436 32，且其精確質(zhì)量數(shù)的誤差應(yīng)當＜10×10－6（見圖1）。蜂毒樣本中只有在精確m/z值和特征碎片離子方面同時滿足以上的特征，方可肯定所求的該蜂毒樣本中的VLTTGLPALISWIK含量可信，并可根據(jù)此含量的高低鑒別蜂毒質(zhì)量；而且在該肽段的色譜峰附近無顯著干擾峰，在定量限時，具有較好的信噪比；此外，在空白樣本中，未觀察到對應(yīng)的信號峰，表明本研究選擇的肽段具有較好的選擇性與特異性。

圖1 未經(jīng)酶切時蜂毒肽色譜圖（A）；經(jīng)酶切后蜂毒肽色譜圖（B）

圖2 未經(jīng)酶切的蜂毒肽母離子質(zhì)譜圖（A）；未經(jīng)酶切的蜂毒肽二級質(zhì)譜圖（B）；經(jīng)酶切的蜂毒肽母離子質(zhì)譜圖（C）；經(jīng)酶切的蜂毒肽二級質(zhì)譜圖（D）；未酶切時加入同位素內(nèi)標質(zhì)譜圖（E）；經(jīng)酶切后加入同位素內(nèi)標質(zhì)譜圖（F）

2.線性關(guān)系。由試驗結(jié)果可知，蜂毒肽特征肽段在3～500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)＞0.99，可見其在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.檢測限、定量限。按照上文方法進行處理，結(jié)果顯示，檢測限為1μg/kg，定量限為3μg/kg。對蜂毒樣品未酶切和經(jīng)酶切后均進行檢測，其檢測限（LOD）、定量限（LOQ）相差較大，樣品酶切后檢測限、定量限更低，檢測更為準確，方法學(xué)驗證結(jié)果見表2和表3。

表2 方法驗證相關(guān)系數(shù)

表3 未酶切與經(jīng)酶切的蜂毒樣品檢測方法學(xué)驗證結(jié)果比較

4.準確性、精密度。本試驗選擇特征肽段高（10LOQ）、 中（2LOQ）、 低（LOQ）3個濃度水平進行回收率和精密度試驗，按上文方法前處理，進行加標回收率試驗?；厥章屎拖鄬藴势罱Y(jié)果見表2。結(jié)果顯示，在低、中、高3個濃度的添加回收率范圍為89.45%～113.23%，日內(nèi)與日間變異系數(shù)均＜11.33%。

（三）開發(fā)的方法在實際樣本檢測中的應(yīng)用采用本方法測定了大量樣品，包括面膜、膏藥、牙膏等市面標有“蜂毒”字樣的產(chǎn)品，從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取肽段的質(zhì)荷比，計算m/z756.463 43處特征肽段和IS肽段峰面積的比值。實測樣本中蜂毒肽的檢出結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，僅有26.92%的蜂毒肽衍生產(chǎn)品中可檢測出蜂毒肽。

三、討論

（一）儀器參數(shù)優(yōu)化將特征肽段及其穩(wěn)定同位素肽段的氨基酸序列輸入Xcalibur軟件中的Isotope simulation工具欄中，酶切得到的多肽在質(zhì)譜正離子模式下通常形成帶雙電荷的離子的穩(wěn)定形式，因此設(shè)置加合方式為[M+2H]2+，模擬特征肽段及其穩(wěn)定同位素肽段的母離子和子離子質(zhì)荷比。

表4 實測樣本中蜂毒肽含量

將特征肽段及其穩(wěn)定同位素肽段溶解、稀釋為1μg/mL，在正離子模式下進行全掃（Full MS/dd MS2），調(diào)整碰撞能量和碰撞氣體（氮氣），對Inclusion list中包含的特征肽段進行碎裂，收集二級離子碎片信息。根據(jù)Full MS/dd MS2掃描結(jié)果，觀察施加給母離子的碰撞能的碰撞效果。在二級圖譜中若母離子信號強度過高則需適當增加碰撞能，反之則減小，一般選擇能量增加或減小5；其次觀察子離子碎片分布情況，若子離子碎片分布在較小的質(zhì)荷比區(qū)域，則略微降低碰撞能，反之則增加，一般將能量以1～2增加或減小。直至母離子信號較弱、子離子質(zhì)荷比又不至于過小且強度較高為止。

（二）蛋白提取方法比較不同蛋白提取方法會造成總蛋白測定結(jié)果不一，進而影響酶切效果和后期的定量結(jié)果。針對這個問題，本實驗參考了5種主要的蛋白質(zhì)提取方法，對不同提取方法得到的蛋白溶液，使用Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒定量檢測蛋白濃度，結(jié)果如圖3所示。綜合蛋白提取濃度和試驗穩(wěn)定性，選擇超濾管濃縮法提取蛋白。

圖3 5種蛋白提取方法比較

（三）方法比較當前常用的檢測方法主要是通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)定量測定完整蜂毒肽，未經(jīng)酶切，檢測其多電荷母離子及子離子進行定量。方法檢測限、定量限較高，定量限多為40 μg/kg，不適用于復(fù)雜基質(zhì)中蜂毒肽含量的檢測。本方法經(jīng)胰蛋白酶酶切后，可將長鏈多肽酶切為較短的短肽，靈敏度更高，更適用于質(zhì)譜檢測。

使用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜（UHPLC－HRMS）對蜂毒樣本進行檢測，未酶切樣品與酶切樣品采用相同的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進行檢測，從結(jié)果中篩選蜂毒肽的特征肽段VLTTGLPALISWIK。對于蜂毒樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行提取，選擇特征肽段的母離子為m/z761.478 35（[M+2H]2+）的二級質(zhì)譜圖，然后在二級質(zhì)譜圖中提取子離子m/z935.604 06和m/z593.436 32。計算、比較胰蛋白酶酶切與未酶切蜂毒樣品中特征肽段/穩(wěn)定同位素內(nèi)標肽段峰面積比，其結(jié)果差異較大。

為提高試驗中定量結(jié)果的準確性，對比之前的外標法定量，本試驗選擇與特征肽段性質(zhì)相似的穩(wěn)定同位素肽段進行定量，確保定量結(jié)果更為準確、可重復(fù)性更高，對內(nèi)源性多肽的質(zhì)譜信號不斷增強，降低了對于給定目標蛋白的特征肽數(shù)量要求。

四、結(jié)論

本文建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定復(fù)雜基質(zhì)中蜂毒肽含量的分析方法，并比較兩種前處理方式（胰蛋白酶酶切與未酶切蜂毒）下本方法的結(jié)果差異。結(jié)果表明，經(jīng)胰蛋白酶酶切、使用同位素內(nèi)標肽段后響應(yīng)更高，檢測限、定量限更低，檢測結(jié)果更為穩(wěn)定，可作為蜂毒肽衍生品中蜂毒肽含量測定的方法。