無糖型強(qiáng)力枇杷露的安全性評價研究＊

陳昕昕，邵田莉，黃秋平，張曉潔，蔡溢，諶紅獻(xiàn)**

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院精神衛(wèi)生研究所，湖南 長沙 410011；2.深圳市康寧醫(yī)院精神科，廣東 深圳 518000）

20世紀(jì)90年代，我們曾發(fā)現(xiàn)何首烏具有肝毒性作用、馬兜鈴酸成分具有腎毒性作用、麻黃具有神經(jīng)毒性作用等，可見，對中藥藥物開展安全性評價十分重要。但由于中藥成分復(fù)雜，具有用藥起效慢、周期長、體內(nèi)作用部位廣等特點，導(dǎo)致安全性評價研究開展的難度較大。

強(qiáng)力枇杷露是《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》中記載的中藥成分藥物制劑[1]，由多種中藥成分及輔料構(gòu)成，因含有罌粟殼成分而具有較好的止咳效果。罌粟殼是《中國藥典》中記載的麻醉制劑、有毒制劑，也是麻醉藥物中唯一的中藥飲片[2]。罌粟殼中的阿片類藥物成分進(jìn)入腦血屏障后作用于延髓，能夠抑制咳嗽中樞及咳嗽反射，起到止咳效果[3]。此外，強(qiáng)力枇杷露中添加的防腐劑輔料苯甲酸鈉，如長期過量服用會損傷神經(jīng)系統(tǒng)[4]，并產(chǎn)生細(xì)胞毒性[5]，提高致癌風(fēng)險[6]。因此，對強(qiáng)力枇杷露進(jìn)行安全性評價具有重要意義。

半數(shù)致死量（Median Lethal Dose，LD50）是指在固定時間內(nèi)（24～48 h）內(nèi)予以實驗物質(zhì)后，能夠引起實驗動物死亡率達(dá)到50%的實驗物質(zhì)的劑量，作為傳統(tǒng)急性經(jīng)口毒性實驗的常用指標(biāo)，用于衡量不同藥物的毒性大小和優(yōu)劣。測量藥物L(fēng)D50方法有很多，常用的有序貫法（即上下法，Up-and-Down Procedure）和霍恩氏法，還有寇氏法、累積法、回歸法（logistic）等。序貫法包括兩個實驗過程，即限度試驗和主實驗[7]，使用程序或者特殊公式來計算LD50，是國際上進(jìn)行急性毒性試驗的替代方法[8]，也是我國政府部門檢測化學(xué)藥物急性毒性的推薦方法[9]。

目前，國內(nèi)對強(qiáng)力枇杷露的研究主要集中在成分和質(zhì)量方面，尚未發(fā)現(xiàn)有針對其安全性開展的研究。強(qiáng)力枇杷露中的嗎啡成分，具有一定的依賴性和毒性。嗎啡的毒理作用表現(xiàn)在體內(nèi)代謝會增加肝臟內(nèi)的自由基，破壞肝臟組織，使體內(nèi)的一氧化氮增加[10]。既往研究中，如對老鼠注射3個月嗎啡，會引起雄性老鼠的生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及數(shù)量減少[11]。嗎啡依賴的小鼠對毒性反應(yīng)更加敏感，腹腔注射甲基苯丙胺的LD50約為正常小鼠的一半[12]。此外，強(qiáng)力枇杷露中的輔料苯甲酸鈉屬于一種防腐劑，同樣具有細(xì)胞毒性[13]。綜合以上情況，研究無糖型強(qiáng)力枇杷露的安全性是有必要的，本文使用序貫法來測量該藥物的LD50，并觀察其毒性作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康未孕雌性Sprague Dawley（SD）大鼠[14]、初始體重200±20 g（由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供）。SD大鼠進(jìn)入實驗室后，置于12 h明暗節(jié)律的動物房內(nèi)一周適應(yīng)，期間予以自由飲食。

1.2 實驗試劑及器材

由無糖型強(qiáng)力枇杷露的廠家提供的10倍濃縮的無糖型強(qiáng)力枇杷露（所有成分和輔料都等比例濃縮10倍）以及未添加罌粟殼成分的無糖型強(qiáng)力枇杷露的10倍濃縮的溶媒試劑；大鼠灌胃針；5 mL注射器；消毒酒精；電子秤。

1.3 給藥方式及分組

SD大鼠的給藥方式為灌胃。通過上下法來進(jìn)行試驗，雖然對于測試未知藥物L(fēng)D50的推薦起始劑量為175 mg·kg-1[14]，但根據(jù)既往嗎啡半數(shù)致死量的研究，我們將無糖型強(qiáng)力枇杷露測試的初始劑量按照其中所含嗎啡的量來計算。嗎啡LD50的范圍在151～257 mg·kg-1[15]，按照250 mg·kg-1來計算，無糖型強(qiáng)力枇杷露中嗎啡的檢測濃度為0.096 mg·mL-1[16]，算出SD大鼠無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50初始測試劑量為2 600 mL·kg-1（250 mg·kg-1/0.096 mg·mL-1≈2 600 mL·kg-1），每只SD大鼠體重按0.2 kg來計算，每日灌胃的劑量為2 600 mL，這在實驗操作過程中是不可能完成的，我們將用10倍濃縮無糖型強(qiáng)力枇杷露、10倍濃縮的溶媒試劑來減少灌胃量。使用10倍濃縮液后，每只SD大鼠的每日灌胃量為52 mL（液體是蒸餾水時，大鼠最大灌胃體積為80 mL·kg-1[17]），灌胃頻率為5 mg·1.5 h-1。

將SD大鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組，實驗組予以含有罌粟殼的10倍濃縮無糖型強(qiáng)力枇杷露，對照組則予以對應(yīng)劑量的10倍濃縮的溶媒試劑。

1.4 實驗方法

在此實驗中我們采取序貫法來測試無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50，這個方法包括兩個實驗，限度實驗和主實驗。

1.4.1 限度實驗步驟

在限度實驗中，采用初始劑量無糖型強(qiáng)力枇杷為2 600 mg·kg-1對SD大鼠進(jìn)行灌胃，若第一只SD大鼠灌胃后（兩周內(nèi)）死亡，則直接進(jìn)入主實驗，LD50＜2 600 mg·kg-1；若第一只大鼠存活，將該劑量繼續(xù)給予另外兩只大鼠，若兩只都存活則存活的SD大鼠總數(shù)達(dá)到3只，LD50≥2 600 mg·kg-1；如果至少有一只大鼠死亡，該劑量繼續(xù)給予另外兩只大鼠，直到存活或死亡的大鼠總數(shù)達(dá)到3只。根據(jù)限度實驗的結(jié)果可估計LD50是否高于此劑量。

圖1 限度實驗的實驗流程

1.4.2 主實驗步驟

根據(jù)限度實驗的結(jié)果，無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50低于2 600 mg·kg-1（相當(dāng)于給予每只大鼠10倍濃縮無糖型強(qiáng)力枇杷露52 mL），因此主實驗中采用該劑量作為第一只SD大鼠的灌胃劑量。在第一只之后的SD大鼠我們將遵循急性藥理毒性試驗指南一般原則。在急性藥物毒性試驗指南中，所選劑量可從以下序列中選擇：1.75 mg·kg-1、5.5 mg·kg-1、17.5 mg·kg-1、55 mg·kg-1、175 mg·kg-1、550 mg·kg-1、1 750 mg·kg-1、5 000 mg·kg-1……[14]。在決定是否對下一只動物灌胃之前，每只SD大鼠都應(yīng)認(rèn)真觀察48小時，后一只動物劑量的上升或下降由前一只動物的死亡或存活決定；從第1只動物改變算起到停止試驗標(biāo)準(zhǔn)之一，停止實驗，計算LD50。無糖型強(qiáng)力枇杷露大概的LD50根據(jù)公式lgLD50=Σ（nX）/Σn計算，其中n是每個劑量的動物總數(shù)，X是每個劑量的對數(shù)劑量，取反對數(shù)就可以獲得大概的無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50。

當(dāng)滿足下列停止實驗標(biāo)準(zhǔn)之一時，停止實驗：

（a）連續(xù)3只動物存活；

（b）任意連續(xù)的6只SD大鼠中有5只連續(xù)發(fā)生存活/死亡轉(zhuǎn)換；

（c）第一只SD大鼠發(fā)生存活/死亡轉(zhuǎn)換之后，至少有4只SD大鼠進(jìn)入試驗，并且其LD50估算值的范圍超出臨界值（2.5倍）。（首次轉(zhuǎn)換的第4只SD大鼠之后，對每次給藥進(jìn)行計算）。

圖2 主實驗的實驗流程

1.4.3 其他觀察指標(biāo)

每天灌胃后連續(xù)觀察動物的反應(yīng)，至少14天，每隔一天觀察一次，以便能觀察到毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間及其恢復(fù)時間、動物死亡時間等。觀察的指標(biāo)包括一般指標(biāo)（如動物外觀如何、活動情況、對刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等）、動物的死亡情況（死亡的時間、瀕死前的反應(yīng)等）等。記錄所有的死亡情況、出現(xiàn)的癥狀，以及癥狀起始的時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間等。

所有的試驗動物均要進(jìn)行大體解剖，包括在試驗過程中因為瀕死而被處死的動物、在實驗過程中死亡的動物及試驗結(jié)束時仍然存活的動物。解剖后發(fā)現(xiàn)組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等方面的改變時，均應(yīng)予以記錄并對其進(jìn)行病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 限度實驗結(jié)果

在限度實驗中，第一只SD大鼠在第四次灌胃后死亡，即20 mL后死亡，按照指南的實驗步驟，我們應(yīng)該進(jìn)入主實驗，但是為了降低操作對SD大鼠造成意外死亡的可能，我們又進(jìn)行了兩對灌胃操作。三對結(jié)果如表1所示：

表1 限度實驗灌胃后SD大鼠的狀態(tài)

由限度實驗結(jié)果，可以推測無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50低于2 600 mg·kg-1。

2.2 主實驗結(jié)果

主實驗結(jié)果如表2所示，首只SD大鼠灌胃量為52 mL（2 600 mg·kg-1），灌胃后大鼠死亡；前一只大鼠死亡，故第2只大鼠的灌胃量選擇低一級的劑量35 mL（1 750 mg·kg-1），灌胃后死亡；故第3只大鼠灌胃劑量為11 mL，灌胃后存活；第4只大鼠灌胃劑量為35 mL，灌胃后死亡；第5只大鼠灌胃劑量為11 mL（550 mg·kg-1），灌胃后存活；第6只大鼠灌胃劑量為35 mL，灌胃后死亡；第7只大鼠灌胃劑量為11 mL，灌胃后存活。此時，從第3只大鼠起到第7只大鼠連續(xù)5次發(fā)生存活/死亡轉(zhuǎn)換，滿足了停止實驗標(biāo)準(zhǔn)的第二條，實驗停止，不再對序列中1.75 mg·kg-1、5.5 mg·kg-1、17.5 mg·kg-1、55 mg·kg-1等劑量進(jìn)行實驗。根據(jù)公式計算得出lgLD50等于3.05，無糖型強(qiáng)力枇杷露在雌性SD大鼠的LD50大概值為1 122 mg·kg-1。

表2 主實驗各劑量級灌胃后實驗組SD大鼠的狀態(tài)

2.3 其他觀察指標(biāo)

在限度實驗和主實驗的實驗過程中，每只予以劑量為175 mg·kg-1及300 mg·kg-1的10倍無糖型強(qiáng)力枇杷露時，實驗組SD大鼠在第3次灌胃后，即15 mL濃縮藥物出現(xiàn)腹部隆起，可觸及腸型；行為方面實驗組較對照組掙扎減少，反射減少，尿量及排便減少，按及膀胱處有尿液排出，口唇的分泌物減少，并在實驗操作當(dāng)天死亡；而對照組在灌胃相同次數(shù)及劑量時，腹部未見明顯隆起，腸型觸及不明顯，活動及反射均較實驗組好，但也弱于灌胃前的狀態(tài)，糞便排出由干燥到稀松。這些實驗組SD大鼠均在第四次灌胃后1小時左右死亡，死亡之前呼吸變得深而慢，活動能力明顯下降。每只予以劑量為55 mg·kg-1的10倍濃縮枇杷露時，雖然SD大鼠的活動減少，腹部稍有膨隆，但其反射存在，有明顯的應(yīng)激反應(yīng)。經(jīng)過14天的觀察，實驗組存活的SD大鼠在第三天逐漸恢復(fù)飲食，大小便恢復(fù)至正常顏色及狀態(tài)；相應(yīng)的對照組活動可，在觀察的第二天，大小便恢復(fù)至正常顏色及狀態(tài)。

每只實驗組的SD大鼠死后及經(jīng)過14天觀察期的SD大鼠，都予以了大體解剖，解剖后發(fā)現(xiàn)在實驗操作當(dāng)天死亡的實驗組SD大鼠的肺葉明顯減??；胃腸道組織蓄積較多的藥品濃縮液，膀胱充盈。存活下來的實驗組SD大鼠及對照組SD大鼠在麻醉后解剖，肺葉未見明顯萎縮，胃腸道中未見明顯液體殘留，膀胱未見明顯充盈。

3 討論

3.1 無糖型強(qiáng)力枇杷露LD50評價

藥物的急性毒理作用一般通過測定動物的LD50及最大給藥量來衡量[18]，在本研究中我們通過LD50 來評價無糖型強(qiáng)力枇杷露的安全性。在本實驗中，根據(jù)上下法測得的無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50的估計值為1 122 mg·kg-1。根據(jù)GHS急性經(jīng)口毒性分級原則，無糖型強(qiáng)力枇杷露的毒性屬于低毒水平[19]。無糖型強(qiáng)力枇杷露臨床推薦劑量為每日45 mL，一個成年人（按體重為60 kg來計算）每天無糖型強(qiáng)力枇杷露的劑量為0.75 mg·kg-1，參考徐叔云《藥理實驗方法學(xué)》轉(zhuǎn)化，按體表面積計算等效劑量的比值來計算，人與SD大鼠的轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.3，SD大鼠的臨床每日推薦劑量為4.725 mg·kg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其LD50。既往對于枇杷露類的研究多側(cè)重于成分、質(zhì)量及臨床應(yīng)用[20]，本研究首次通過上下法測定無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50，結(jié)果顯示該藥物的毒性作用較低。

3.2 生理狀況及解剖結(jié)果評價

在給SD大鼠灌胃過程中，觀察到SD大鼠在灌胃15 mL的10倍濃縮液后，相當(dāng)于成人劑量7 143 mL（15 mL×10 / 0.2 kg×60 kg / 6.3=7 143 mL），SD大鼠的活動明顯減少，呼吸開始變得急促，腹部可觸及腸型，刺激肛門時，SD大鼠的大小便較對照組明顯減少，表示藥物抑制了消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)的功能。在灌胃20 mL的濃縮液后，相當(dāng)于成人劑量9 524 mL（20 mL×10 / 0.2 kg×60 kg / 6.3=9 524 mL），SD大鼠死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)SD大鼠的肺部明顯萎縮，胃腸道內(nèi)充滿藥物，膀胱也是充盈狀態(tài)。以上實驗結(jié)果都顯示無糖型強(qiáng)力枇杷露在大劑量使用時具有鎮(zhèn)靜、抑制呼吸、抑制胃腸蠕動及排空、引起尿潴留的作用。

3.3 阿片類物質(zhì)的影響

無糖型強(qiáng)力枇杷露中含有罌粟殼，其中的嗎啡及可待因等成分都屬于阿片類物質(zhì)。阿片類物質(zhì)能通過血腦屏障，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用[21]；阿片類物質(zhì)還能抑制消化系統(tǒng)的腺體分泌，導(dǎo)致胃排空延遲，幽門及回盲括約肌運(yùn)轉(zhuǎn)延遲[22]；在過量使用時，還會導(dǎo)致呼吸抑制的嚴(yán)重不良事件[23]；對于泌尿系統(tǒng)的影響是會引起尿潴留，主要是由于阿片類物質(zhì)影響抗利尿激素的釋放，并導(dǎo)致尿道平滑肌痙攣[24]。由于對照組SD大鼠未出現(xiàn)上述毒性反應(yīng)，提示無糖型強(qiáng)力枇杷露中含有的罌粟殼可能是導(dǎo)致呼吸、消化和泌尿系統(tǒng)毒性的主要因素。

3.4 輔料的影響

苯甲酸鈉是無糖型強(qiáng)力枇杷露的輔料之一，是一種常見的防腐劑。苯甲酸鈉會干擾微生物細(xì)胞膜的通透性，影響細(xì)胞膜對氨基酸的吸收；苯甲酸分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，會抑制微生物細(xì)胞內(nèi)的呼吸酶系統(tǒng)，使微生物ATP的產(chǎn)生減少或停止，從而起到防腐的作用[25]。在主實驗和限度實驗中，對照組SD大鼠經(jīng)過不含罌粟殼的10倍濃縮溶媒試劑灌胃后，在14天的觀察期內(nèi)均存活，且未見明顯的毒性作用，該結(jié)果提示無糖型強(qiáng)力枇杷露中的輔料苯甲酸鈉可能不是其產(chǎn)生毒性反應(yīng)的主要因素，即便如此苯甲酸鈉的毒性也不可忽視。

綜上所述，無糖型強(qiáng)力枇杷露的毒性分級屬于低毒水平，其中的罌粟殼及苯甲酸鈉等成分在既往研究中都明確表示過量會產(chǎn)生毒理反應(yīng)，因此在臨床使用時要嚴(yán)格根據(jù)使用說明書及醫(yī)囑服藥。

4 結(jié)論

無糖型強(qiáng)力枇杷露的LD50約為1 122 mg·kg-1，毒性分級屬于低毒等級，根據(jù)無糖型強(qiáng)力枇杷露的推薦臨床服用劑量是安全的，并不會引起上述的毒理反應(yīng)。但使用過大劑量時對SD大鼠胃腸蠕動、呼吸、泌尿及行為反射都有抑制作用，嚴(yán)重時會導(dǎo)致SD大鼠的死亡。