Antagomir-30d對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

汪艷，金瓊，陳威，黃慧

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 種植科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 兒童口腔科，浙江 溫州 325027；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 修復(fù)科，上海 200011

微小RNA（microRNA，miRNA）是小的內(nèi)源性RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[1]。本課題組在前期對(duì)成骨調(diào)控的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)miRNA參與釉基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過(guò)程，挑選出了一系列發(fā)生顯著表達(dá)異常的miRNAs。其中miR-30家族成員miR-30a、miR-30b、miR-30c和miR-30d在成骨分化過(guò)程中顯著下調(diào)，同時(shí)這些家族成員的抑制劑則可以促進(jìn)成骨分化[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-30家族成員可恢復(fù)骨吸收與骨生成間的平衡[3]。由于miRNA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，對(duì)miRNA產(chǎn)品的穩(wěn)定性提出了更高的要求，本研究將采用穩(wěn)定性更好、可靠性更高的化學(xué)修飾miRNA antagomir進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平進(jìn)行miR-30d拮抗劑（antagomir-30d）及其陰性對(duì)照（NC）的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證antagomir-30d在細(xì)胞水平對(duì)成骨分化的調(diào)控作用，并通過(guò)轉(zhuǎn)染不同濃度后成骨基因表達(dá)水平確定其最佳轉(zhuǎn)染濃度。

1 材料和方法

1.1 材料 4周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DME培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，SYBR?PrimeScript?RTPCR Kit購(gòu)自日本Takara公司，RNAse Free Water購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，引物購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司，cDNA合成試劑購(gòu)自日本Takara公司，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的獲取和培養(yǎng)方法：大鼠脫臼處死，置于75%乙醇中浸泡消毒10 min，無(wú)菌條件下取其脛骨和股骨，剔除周圍附著肌肉，將其兩端干骺端剪除，顯露骨髓腔。10 mL無(wú)菌注射器吸取含有肝素（200 U/mL）和10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至由紅色變白色。細(xì)胞懸液以1 800 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液，并加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液10 mL，用滴管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后接種于10 cm培養(yǎng)皿。放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日首次換液后每3 d換一次液。待鏡下觀察細(xì)胞增殖至80%時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，0.25%胰酶和0.02%EDTA消化培養(yǎng)皿底貼壁細(xì)胞，約1～2 min至鏡下見(jiàn)貼壁細(xì)胞皺縮后，加入適量培養(yǎng)液終止消化，吸取培養(yǎng)液輕吹尚未脫落的細(xì)胞至所有細(xì)胞懸起，然后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，吹打使之分散均勻。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入α-MEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，輕輕吹打使細(xì)胞分散均勻，接種于數(shù)個(gè)10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換一次液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。待細(xì)胞增殖至80%時(shí)按上述操作進(jìn)行傳代。采用第2或3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞行成骨誘導(dǎo)分化時(shí)，需采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

1.2.2 待轉(zhuǎn)染試劑準(zhǔn)備方法：Antagomir-30d是經(jīng)過(guò)特殊化學(xué)修飾的miR-30d的拮抗劑，適用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。NC采用無(wú)意義的一段核苷酸，用于antagomir-30d的陰性對(duì)照；antagomir-30d、NC以及用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率經(jīng)Cy3熒光標(biāo)記的NC均由廣州銳博生物科技有限公司合成提供，由于經(jīng)過(guò)特殊化學(xué)修飾，使用時(shí)無(wú)需轉(zhuǎn)染試劑即可跨越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。產(chǎn)品以凍干粉的形式，常溫運(yùn)輸，并于-80～-20 ℃保存。使用前需將其配置為20 μmol/L的儲(chǔ)備液，操作步驟：低速條件下離心儲(chǔ)存管，讓凍干粉聚集在試管的底部。輕輕打開管蓋，加入DEPC水若干，配成20 μmol/L的儲(chǔ)備液，柔和地用移液槍吹打儲(chǔ)備液5次。根據(jù)具體用量分裝，避免多次凍融，重新貯存時(shí)注意密封好EP管，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩楸苊馔饨缫蛩兀ò?、極端pH或溫度條件等）導(dǎo)致產(chǎn)品降解，所有操作均嚴(yán)格遵循RNA操作規(guī)則。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑于冰上放置。

1.2.3 細(xì)胞處理方法：采用第2或3代BMSCs鋪板于六孔板底，每孔的細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL。分為3組：不同濃度的antagomir-30d（antagomir-30d組）、陰性對(duì)照（NC組）和未做轉(zhuǎn)染的BMSCs（空白組），每組3個(gè)復(fù)孔。鋪板后次日antagomir-30d組與NC組分別加入antagomir-30d與NC，終濃度依次為50、100、150、200 nmol/L，空白組不做處理。48 h后更換成骨誘導(dǎo)液，每3 d換一次液，培養(yǎng)至7 d，收集細(xì)胞。選用不同濃度的antagomir-30d及其NC進(jìn)行BMSCs的轉(zhuǎn)染，通過(guò)RT-PCR技術(shù)測(cè)定成骨基因ALP、骨鈣素（osteocalcin，OC）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的mRNA表達(dá)量，以確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。

1.2.4 RT-PCR方法：TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA。依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢大鼠相關(guān)基因的mRNA序列，應(yīng)用Oligo 6.71軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因選用GAPDH基因，引物序列為網(wǎng)站上已報(bào)道的序列。引物由上海生工生物工程公司（http：//www.sangon.com/）合成，保存濃度為100 pmol/μL，工作濃度為10 pmol/μL。將所有cDNA樣品分別配置RT-PCR反應(yīng)體系，加樣。表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR使用的引物序列

1.2.5 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染方法：采用第2或第3代BMSCs鋪板于六孔板底，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，每孔的細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%（推薦轉(zhuǎn)染密度），另設(shè)2個(gè)復(fù)孔。鋪板次日，將Cy3熒光（紅色熒光染料）標(biāo)記的NC加入六孔板中，使其濃度達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染濃度。48 h后取出六孔板，去原液，用PBS洗滌3遍后置熒光顯微鏡下（Olympus IX71）觀察，顯微參數(shù)為550 nmol/L激發(fā)波長(zhǎng)，570 nmol/L發(fā)射波長(zhǎng)。100倍視野下兩人同時(shí)獨(dú)立計(jì)數(shù)相同視野下紅色熒光數(shù)，每孔共計(jì)5個(gè)高倍鏡視野。每孔轉(zhuǎn)染效率（%）=紅色熒光數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。每孔5個(gè)高倍鏡視野取平均值，最終每組3孔平均值確定為轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 ALP染色方法：采用第2或3代BMSCs鋪板于六孔板底，每孔的細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL。共分3組：空白組、antagomir-30d組、NC組。鋪板后次日antagomir-30d組與NC組分別加入antagomir-30d與NC，終濃度為RT-PCR檢測(cè)的最佳濃度，空白組不做處理。48 h后更換成骨誘導(dǎo)液，每3 d換一次液，培養(yǎng)至7 d，行ALP染色，檢測(cè)ALP活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察 全骨髓接種5 d后貼壁細(xì)胞主要為BMSCs，貼壁細(xì)胞形成大小不等分散的細(xì)胞集落，形態(tài)多呈梭形，見(jiàn)圖1A。7 d后細(xì)胞集落數(shù)量明顯增加，且集落內(nèi)細(xì)胞呈漩渦狀排列，集落明顯增大，并呈放射狀向周圍擴(kuò)張，細(xì)胞集落間相互融合成為單層，見(jiàn)圖1B。待細(xì)胞融合度達(dá)80%即可消化傳代。

圖1 原代大鼠BMSCs的形態(tài)（×100）

2.2 不同濃度各組細(xì)胞成骨基因表達(dá) 成骨誘導(dǎo)7 d后，antagomir-30d組、NC組和空白組均可檢測(cè)到成骨相關(guān)基因的表達(dá)，見(jiàn)圖2。各濃度NC組與相同濃度空白組成骨基因ALP、OC及RUNX2的mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為150 nmol/L，antagomir-30d組ALP、OC和RUNX2的mRNA表達(dá)量與NC組和空白組比均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染濃度確定 選用0、50、100、150、200 nmol/L濃度的antagomir-30d對(duì)BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染并經(jīng)成骨誘導(dǎo)。150 nmol/L濃度的antagomir-30d ALP的mRNA表達(dá)量與0 nmol/L比顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各濃度的antagomir-30d OC和RUNX2 mRNA表達(dá)量與0 nmol/L比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)antagomir-30d濃度為150 nmol/L時(shí)成骨效果最佳，見(jiàn)圖3。

2.4 BMSCs轉(zhuǎn)染效率觀察 Cy3熒光標(biāo)記的NC以最佳濃度150 nmol/L轉(zhuǎn)染BMSCs 48 h后，光鏡見(jiàn)BMSCs形成一層貼壁細(xì)胞，增殖至約70%，漂浮死細(xì)胞較少；熒光顯微鏡觀察示BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)68.75%±8.54%，見(jiàn)圖4。

2.5 各組ALP染色結(jié)果 150 nmol/L antagomir-30d組、NC組和空白組7 d后BMSCs ALP染色均呈紫色（＋）；空白組與NC組染色程度接近，均淺于antagomir-30d組，見(jiàn)圖5。

圖2 不同濃度各組BMSCs成骨誘導(dǎo)7 d后成骨基因mRNA表達(dá)水平比較

圖3 各濃度antagomir-30d各成骨基因mRNA表達(dá)水平比較

圖4 BMSCs轉(zhuǎn)染效率觀察

圖5 各組ALP染色結(jié)果比較

3 討論

研究表明miR-30a和miR-30d在人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（human bone morphogenetic protein 2，BMP-2）誘導(dǎo)C2C12間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中發(fā)生下調(diào)[4]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)在對(duì)成骨調(diào)控的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)miRNA參與釉基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的成骨分化過(guò)程，并挑選出一系列發(fā)生顯著表達(dá)的miRNAs，其中miR-30家族成員miR-30a、miR-30b、miR-30c和miR-30d在釉基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨分化過(guò)程中顯著下調(diào)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明Smad1和RUNX2是miR-30家族的靶基因，當(dāng)Smad1和RUNX2過(guò)表達(dá)時(shí)會(huì)顯著減少miR-30家族對(duì)成骨分化的抑制作用[2]。因此miR-30家族是成骨分化關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子，并通過(guò)負(fù)調(diào)控Smad1和RUNX2的表達(dá)而發(fā)揮成骨抑制作用。本研究挑選miR-30d作為調(diào)節(jié)因子，選用穩(wěn)定性更好、可靠性更高的化學(xué)修飾的miR-30d拮抗劑antagomir-30d及其無(wú)意義對(duì)照鏈NC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

BMSCs作為成骨細(xì)胞的主要來(lái)源，是骨髓腔中的主要細(xì)胞，它是一種具有自我更新能力及多重分化能力的干細(xì)胞，在特定條件下可以向骨、軟骨、脂肪等多種組織細(xì)胞分化[5]。BMSCs在礦化誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件下，可以向成骨細(xì)胞分化，并表現(xiàn)出較高的ALP活性，可分泌OC和I型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)。BMSCs可在骨重建和損傷再生中發(fā)揮重要的作用[6]。另外，BMSCs體外增殖能力強(qiáng)，取材容易，免疫原性低，并且能夠趨化成骨前體細(xì)胞至骨缺損部位誘導(dǎo)激活植入體處早期骨形成的通路，目前被認(rèn)為是促進(jìn)體內(nèi)成骨的優(yōu)良種子細(xì)胞源。

BMSCs的成骨分化能力與其合成分泌的酶以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白關(guān)系密切。ALP是細(xì)胞發(fā)生分化時(shí)所分泌產(chǎn)生的酶，成骨細(xì)胞從其前體細(xì)胞開始即表達(dá)ALP，在成熟的成骨細(xì)胞中ALP表達(dá)增加，但在成熟的骨細(xì)胞中ALP活性逐漸消失。因此，ALP活性被認(rèn)為是反映成骨細(xì)胞成熟狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，又被認(rèn)為是成骨的早期指標(biāo)。ALP表達(dá)活性越高說(shuō)明BMSCs向成骨細(xì)胞的分化越明顯[7]。OC是含量最豐富的骨非膠原蛋白，由成熟的成骨細(xì)胞合成。OC主要出現(xiàn)在礦化形成期，是反映成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志，而且能準(zhǔn)確代表成骨細(xì)胞的活性和骨轉(zhuǎn)換。RUNX2是調(diào)節(jié)成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)ALP、OC等多種下游成骨基因的表達(dá)，RUNX2的表達(dá)反映新骨的形成[8]。

MiRNA產(chǎn)品的最佳工作濃度因細(xì)胞類型及研究目的不同而異?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染濃度，建議10～200 nmol/L。在研究miR-196b的表達(dá)與白血病的發(fā)展關(guān)系的實(shí)驗(yàn)中，研究人員采用100 nmol/L濃度的antagomir-196b進(jìn)行野生型C57BL6小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染[9]。為了明確antagomir-30d及其NC轉(zhuǎn)染至大鼠BMSCs的最佳轉(zhuǎn)染濃度，本研究共采用轉(zhuǎn)染因子的5個(gè)濃度梯度0、50、100、150、200 nmol/L進(jìn)行比較，并檢測(cè)各成骨基因ALP、OC、RUNX2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

由于轉(zhuǎn)染時(shí)所接種的細(xì)胞密度是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素之一，因此細(xì)胞接種密度過(guò)高和生長(zhǎng)過(guò)度會(huì)削弱細(xì)胞活力，降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在將anti-miR-21（miR-21的反義鏈）運(yùn)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至人HXO-RB44細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀顯示其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)約69.85%[10]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者構(gòu)建了大鼠microRNA-327重組腺病毒載體并轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，48 h后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示腺病毒轉(zhuǎn)染效率為90.15%±5.15%，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率為85.46%±3.08%[11]。銳博公司推薦轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)使接種細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%。熒光標(biāo)記的miRNA產(chǎn)品可采用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡等觀察到，可直觀地評(píng)估m(xù)iRNA產(chǎn)品的轉(zhuǎn)染效率。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為150 nmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)染48 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)68.75%±8.54%。

Antagomir-30d通過(guò)轉(zhuǎn)染BMSCs后可以促進(jìn)其成骨分化，與空白及NC組比，相關(guān)成骨基因ALP、OC、RUNX2 mRNA表達(dá)上調(diào)，ALP染色活性增加；當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為150 nmol/L時(shí)，antagomir-30d促進(jìn)成骨分化的效果最好，各成骨基因的表達(dá)量上調(diào)最明顯。