低聚果糖通過調(diào)整腸道菌群改善川崎病小鼠冠狀動脈損傷的機制

錢范宇，章啟豪，岑建柯，周錦慧，李睿心，葉子，吳夢涵，王方巖，褚茂平，張春祥

1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童心血管內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學病理生理學教研室，浙江 溫州 325035

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種好發(fā)于6個月至2歲嬰幼兒，以全身血管炎癥為主要病變的急性獲得性心血管疾病[1-2]。其最主要的并發(fā)癥為冠狀動脈病變，一直未經(jīng)治療的KD有25%的病例會發(fā)展成為冠狀動脈瘤，威脅患兒生命健康[3]。目前KD的發(fā)病原因及內(nèi)在機制仍未被完全闡明。有研究認為，免疫系統(tǒng)的異常激活、炎癥因子的級聯(lián)放大效應為其中比較重要的病理機制，而巨噬細胞作為KD血管炎癥的驅(qū)動因素尤為重要[4-6]。

腸道微生態(tài)是微生物、細菌、病毒、原生動物和真菌，以及它們在胃腸道中存在的集體遺傳物質(zhì)的總和[7]。研究表明，許多全身性疾病的發(fā)生發(fā)展與腸道微生態(tài)的變化密切相關。有學者對KD患兒的腸道菌群16S測序發(fā)現(xiàn)，KD腸道菌群存在明顯失衡，主要表現(xiàn)為有害菌（如鏈球菌屬、腸球菌屬）的增加和有益菌（如乳酸桿菌屬）的減少[8-10]。但目前針對腸道菌群與KD冠狀動脈損傷程度的研究鮮有報道。

低聚果糖（fructo-oligosaccharide，F(xiàn)OS）是一種益生元，能促進腸道內(nèi)產(chǎn)短鏈脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFAs）益生菌的增殖，抑制有害菌的生長，保持腸道微生態(tài)的平衡[11]。其中最主要的3種SCFAs乙酸、丙酸、丁酸已被證實可以通過多種機制抑制炎癥，影響全身疾病如炎癥性腸病、胰腺炎、動脈粥樣硬化等的發(fā)生發(fā)展[12-15]。而對于KD來說，SCFAs在腸道內(nèi)的含量變化是否會改變KD冠狀動脈的病理損傷，尤其是冠狀動脈炎癥性病變?nèi)孕柽M行探究。本研究探討FOS是否通過調(diào)整腸道菌群改善KD小鼠冠狀動脈損傷，并對其機制進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級C57BL/6雄性小鼠30只，體質(zhì)量18～20 g，4～6周齡，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號碼：SYXK（浙）2018-0017。HE染色試劑購自北京索萊寶有限公司，CD68一抗試劑購于美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 KD小鼠動物模型的建立：按照文獻KD模型造模方法[16-17]，采用白色念珠菌細胞壁水溶性成份（candida albicans cell wall extracts，CAWS）腹腔注射[4 mg/（只·d），連續(xù)5 d]，建立KD小鼠模型。小鼠隨機分為正常對照組（PBS組），KD造模組（CAWS組），F(xiàn)OS+KD造模組（FOS組）3組，每組10只。以相同方式腹腔注射PBS后正常飼養(yǎng)作為正常對照。FOS組除了飼料中加入了5%的FOS外，其余同CAWS組。造模過程中，每天對小鼠進行兩次檢查，特別關注特定的疾病體征，包括體質(zhì)量減輕＞10%、活動能力下降、皮毛皺褶、駝背步態(tài)、不活動或進食和飲水困難。如果在任何時候出現(xiàn)兩種或兩種以上的癥狀，就用戊巴比妥鈉將動物進行人道處死。造模完成后28 d處死各組小鼠，每只小鼠取2份糞便樣本，立即液氮冷凍，及時送檢。取心臟組織置于-80 ℃環(huán)境保存。

1.2.2 HE染色：按照HE試劑盒說明書，對各組小鼠心肌切片進行染色，觀察冠狀動脈的炎癥情況。

1.2.3 組織免疫熒光染色：心肌組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片步驟。浸泡二甲苯15 min 2次后，梯度水化，PBS洗2次5 min后進行高壓抗原修復，后用5% BSA封閉，最后用CD68（1:100，美國Proteintech公司）處理，4 ℃冰箱過夜。第2天取出復溫30 min，PBS洗3遍后，加熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3遍后加DIPI熒光淬滅劑封片，鏡檢。

1.2.4 糞便16S rRNA檢測：每只小鼠的糞便送至北京諾和致源科技股份有限公司，運用高通量測序技術(shù)，進行16S rRNA V3和V4區(qū)擴增和測序，并在其Illumina MiSeq測序平臺進行分析。

1.2.5 糞便SCFAs含量測定：取樣本50 mg，加50 μL 15%磷酸，再加上125 μg/mL的內(nèi)標（異己酸）溶液100 μL和乙醚400 μL勻漿1 min，于4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清液。運用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GS-MS）檢測方法，對糞便中SCFAs乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸的含量進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS21.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FOS減少KD冠狀動脈炎癥浸潤，改善病理損傷各組小鼠心肌冠狀動脈HE染色發(fā)現(xiàn)，CAWS組小鼠冠狀動脈結(jié)構(gòu)與PBS組不同，出現(xiàn)水腫增厚和管腔縮小的變化，且周圍原本正常的心肌組織已完全消失，取而代之的為大量染色較深的單核細胞等炎癥細胞，提示冠狀動脈損傷嚴重（見圖1A）。免疫熒光顯示CAWS組冠狀動脈周圍CD68熒光強度（紅色）明顯增強（見圖1B），說明巨噬細胞浸潤明顯，炎癥較為嚴重。FOS處理后冠狀動脈周圍損傷明顯減輕（見圖1A），巨噬細胞熒光強度減弱，浸潤范圍縮?。ㄒ妶D1B）。

圖1 各組心肌冠狀動脈HE染色（A）和CD68組織熒光染色（B）

2.2 FOS改善KD小鼠腸道菌群變化 通過對小鼠糞便細菌的16S rRNA的V3-V4區(qū)段進行高通量測序，結(jié)果顯示CAWS組的腸道菌群與PBS組的明顯不同，菌群組成形成差異（見圖2A），菌群種類下降（見圖2B）。通過熱圖在門水平和屬水平同樣能發(fā)現(xiàn)CAWS組腸道菌群相較于PBS組出現(xiàn)紊亂（見圖2CD）。KD造模的小鼠在加入FOS后，腸道菌群出現(xiàn)明顯的調(diào)整，厚壁菌門（Firmicutes）比例重新上升（見圖2C），其中能發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs的菌屬Klebsiella、Lachnospiraceae、Citrobacter等出現(xiàn)上升（見圖2D）。

2.3 FOS上調(diào)了腸道菌群中產(chǎn)SCFAs的菌群比例已知厚壁菌門是產(chǎn)SCFAs菌群較為集中之處，于是我們觀察到在門水平上，F(xiàn)OS組的菌群比例接近于PBS組。與CAWS組相比，F(xiàn)OS組中厚壁菌門出現(xiàn)上升，擬桿菌門（Bacteroidetes）出現(xiàn)下降（見圖3A），且發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生SCFAs的毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae）出現(xiàn)明顯的上升（見圖3B）。通過對前40種差異菌屬中的產(chǎn)SCFAs菌進行分析，我們發(fā)現(xiàn)CAWS組中產(chǎn)生SCFAs的細菌Blautia、Roseburia、Bacteroides明顯減少，F(xiàn)OS干預后出現(xiàn)明顯的上升（見圖3C-E）。

2.4 FOS提高了SCFAs產(chǎn)量 為了更加直觀地了解產(chǎn)SCFAs菌種差異是否確實影響腸道內(nèi)SCFAs的含量，我們用GS-MS法直接測定糞便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸的含量，結(jié)果顯示，相對于PBS組，CAWS組所檢測的SCFAs均出現(xiàn)降低（P＜0.05），經(jīng)FOS處理后，這些SCFAs含量顯著增加（見圖4）。

3 討論

腸道菌群對機體生理功能和各系統(tǒng)器官疾病的發(fā)生發(fā)展均有十分重要的影響。在心血管炎癥方面，已有廣泛研究明確了菌群是重要的參與者。6個月至3歲是腸道微生態(tài)構(gòu)建的關鍵時期，也是KD的高發(fā)期，這提示腸道菌群與KD之間很可能存在密切的聯(lián)系。前期的研究已發(fā)現(xiàn)KD患兒的菌群與正常兒童相較具有顯著的差異[9-10]，但這種差異與KD嚴重程度的相關性仍有待明確。

FOS是一種生產(chǎn)商品化并且應用廣泛的益生元，在腸道內(nèi)能促進有益菌的生長。FOS通過調(diào)整腸道菌群組成，增加SCFAs等有益代謝產(chǎn)物生成，從而增強腸道免疫屏障。有報道稱定期攝入足夠的FOS對腸胃疾病、肥胖、腹瀉、骨質(zhì)疏松、動脈粥樣硬化和2型糖尿病等疾病均有益處[11]。而FOS是否有益于KD，目前未見此方面的研究。我們發(fā)現(xiàn)給KD小鼠攝入定量的FOS后，其冠狀動脈周圍病理損傷明顯減輕，巨噬細胞的浸潤情況也明顯緩解。為深入探究KD小鼠是否確實存在腸道菌群紊亂的情況，以及FOS的攝入是否重新調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，我們采用16S rRNA測序技術(shù)檢測小鼠糞便中的菌群組成情況，結(jié)果顯示KD小鼠的腸道菌群與正常小鼠腸道菌群存在較大差異，出現(xiàn)明顯的紊亂現(xiàn)象；而加入FOS后，腸道菌群比例重新趨于正常。有研究顯示來自厚壁菌門的Phascolarctobacterium、Roseburia、Blautia、Faecalibacterium、Clostridium、Subdoligranulum、Ruminococcus、Coprococcus屬以及來自擬桿菌門的Bacteroides屬共9個菌均屬具有產(chǎn)生SCFAs的能力，屬于有益菌群[18]。以此為參照，本研究關注到前40個各組差異最明顯的菌群中，CAWS組產(chǎn)SCFAs的菌群均下降，加入FOS后部分產(chǎn)SCFAs菌群上升。SCFAs的結(jié)果提示，在FOS處理后確實提高了糞便中SCFAs含量。以此我們認為，F(xiàn)OS可能通過提高腸道內(nèi)產(chǎn)SCFAs有益菌群的比例，減輕KD的冠狀動脈損傷。

圖2 小鼠糞便16S rRNA高通量測序

圖3 各組腸道菌群差異

圖4 各組糞便中SCFAs的含量

近年，SCFAs，特別是乙酸、丙酸、丁酸的抗炎效應已得到廣泛的認可。在心血管疾病方面，BARTOLOMAEUS等[19]在小鼠的高血壓模型中發(fā)現(xiàn)，SCFAs（如丙酸）的抗炎作用顯著減少了效應記憶T細胞和Th17細胞的數(shù)量，從而減輕高血壓造成的心血管損傷。Casp1-/-小鼠中產(chǎn)生SCFAs的微生物群減少，進而導致盲腸中微生物來源的丙酸、乙酸和丁酸減少，從而加速炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生[20]。丁酸也可以通過抑制氧化應激和炎癥，抑制血管平滑肌增殖，對心血管產(chǎn)生保護作用，如抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，調(diào)節(jié)血壓等[12，14]。目前SCFAs在KD中的研究甚少，近期有報道發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)的SCFAs特別是丁酸產(chǎn)量下降造成的Th17/Treg失衡，可導致KD的高細胞因子血癥的發(fā)生[21]。我們通過實際測量糞便中的SCFAs確實發(fā)現(xiàn)在FOS處理后所有SCFAs上升，故本研究中FOS可能是通過提高腸道內(nèi)有抗炎能力的SCFAs，來緩解KD冠狀動脈損傷情況。目前研究表明SCFAs的抗炎效應主要是通過G蛋白偶聯(lián)受體通路完成，如乙酸和丁酸作用于GPR41和GPR43，丁酸則通過丁酸的特性受體GPR109A或者GPR43發(fā)揮作用[22-24]。此外，組蛋白去乙?；傅囊种谱饔靡彩嵌∷嵋盅椎耐緩街籟25]。丁酸因在心血管系統(tǒng)疾病中表現(xiàn)出顯著的抑炎作用，故我們推測可能是丁酸在KD中發(fā)揮了作用，但具體機制還有待進一步探索。

綜上所述，F(xiàn)OS能恢復KD炎癥小鼠的腸道微生態(tài)，增加有益菌群，特別是產(chǎn)SCFAs菌，從而提高腸道內(nèi)SCFAs濃度，減輕巨噬細胞浸潤造成的KD冠狀動脈損傷。