Nrf2基因敲除加劇單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化模型中巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥損傷作用

吳存造，陸紅，朱恒悅，翁敏，施程浩，林周豪，白永恒

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.泌尿外科；2.檢驗(yàn)科；3.浙江省胰腺肝臟危重性疾病診治新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

氧化應(yīng)激損傷是各種類型腎損傷的重要病理因素，可直接或間接地引起腎皮質(zhì)固有免疫細(xì)胞活化及周圍組織、血管中大量炎癥細(xì)胞的浸潤。浸潤的炎癥細(xì)胞又可釋放炎癥介質(zhì)，使腎皮質(zhì)缺氧程度進(jìn)一步加重，進(jìn)而引起腎小管損傷、腎缺血和纖維化，形成惡性循環(huán)[1]。巨噬細(xì)胞是腎氧化應(yīng)激損傷過程中重要的免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，其活化通過釋放誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等物質(zhì)，誘導(dǎo)局部炎癥損傷，參與間質(zhì)纖維化進(jìn)程[2]。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）是機(jī)體重要的抗氧化應(yīng)激損傷分子[3]。氧化應(yīng)激損傷時(shí)，反應(yīng)性氧代謝產(chǎn)物（reactive oxygen species，ROS）等可誘導(dǎo)Nrf2解耦聯(lián)，使之進(jìn)入細(xì)胞核并與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidative response element，ARE）結(jié)合，激活下游多種基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其抗氧化活性[4]。然而，Nrf2是否參與腎纖維化過程中的炎癥反應(yīng)及影響巨噬細(xì)胞活化尚不十分清楚。本研究以臨床上常見的單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）誘導(dǎo)腎纖維化模型作為研究對象，通過分析Nrf2基因敲除后，巨噬細(xì)胞的活化及其調(diào)控機(jī)制，以明確抗氧化應(yīng)激分子Nrf2在腎炎癥損傷和纖維化中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：Nrf2（Nfe212）基因敲除小鼠（B6.129X1-Nfe212tm1ywk/J）購于南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，動(dòng)物許可證號為SCXK（蘇）2015-0001。野生型B6小鼠（C57BL/6）購于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號：SYXK（浙）2019-0009。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)程序嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例執(zhí)行。

1.1.2 試劑：PAS染色試劑購于上海碧云天生物公司；Masson試劑盒購于北京Solarbio公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中杉金橋公司；抗CD68單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；iNOS試劑盒購于武漢Proteintech公司；干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor，IRF5）抗體購于美國Proteintech公司；TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Toyobo公司。

1.1.3 儀器：MyCycler梯度PCR儀購于美國Bio-Rod公司；7500 Fast定量PCR儀購于美國Applied Biosystens公司；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀購于美國Thermo Scientific公司；DM4000B LED熒光正置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和UUO模型的制備：將實(shí)驗(yàn)小鼠分為：Nrf2野生型UUO組（Nrf2Wild-typeUUO）、Nrf2野生型假手術(shù)組（Nrf2Wild-typeSham）、Nrf2敲除型UUO組（Nrf2KOUUO）和Nrf2敲除型假手術(shù)組（Nrf2KOSham），每組6只。用10%水合氯醛成功麻醉小鼠，對腹部進(jìn)行常規(guī)消毒后，取左側(cè)腹部切口，找到左腎下極并游離左側(cè)輸尿管，并于靠近腎盂處結(jié)扎左側(cè)輸尿管，隨后將腹內(nèi)臟器復(fù)位后腹壁縫合。假手術(shù)組僅分離腎臟及游離輸尿管，隨即縫合腹壁。各組小鼠于術(shù)后7 d，取左腎組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PAS染色檢測腎組織病理學(xué)改變：腎組織樣本取出后，使用4%多聚甲醛對其進(jìn)行固定。腎組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后，切成4 μm厚組織切片，制備成石蠟切片。切片經(jīng)過脫蠟、梯度乙醇后，通過PAS染色，最后使用中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察腎組織皮質(zhì)和髓質(zhì)的病理學(xué)改變。

1.2.3 Masson染色檢測腎組織纖維化：脫蠟后4 μm的石蠟切片根據(jù)Masson試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。使用蘇木素-三氯化鐵染核10 min，流水稍洗；鹽酸乙醇分化后，流水沖洗；氨水返藍(lán)，水洗；麗春紅酸性染液進(jìn)行染色10 min，醋酸清洗1 min；1%磷鉬酸作用2 min，苯胺藍(lán)染色2 min；然后用95%乙醇分化30 s；脫水、透明、封片、鏡檢。在Masson染色之后，肌纖維為紅色，膠原纖維為藍(lán)色。Masson染色組織評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測CD68和IRF5的表達(dá)：已制作的石蠟切片采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶法進(jìn)行染色。對CD68、iNOS和IRF5等一抗按1:200進(jìn)行稀釋。常規(guī)脫蠟水化后，枸櫞酸鹽高溫進(jìn)行修復(fù)抗原，以二抗相同來源的血清封閉。使用一抗稀釋液作為陰性對照，細(xì)胞核、細(xì)胞漿或胞膜出現(xiàn)黃褐色顆粒即為陽性表達(dá)。最后用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個(gè)視野下陽性表達(dá)區(qū)域的平均光密度值（累積光密度/分析面積）。

1.2.5 ELISA檢測iNOS的水平：取100 mg腎組織，充分勻漿溶解于1 mL的PBS液內(nèi)，離心分離出上清液，制成100 g/L蛋白原液，根據(jù)試劑盒說明書，采用雙抗體夾心ELISA法，檢測樣品吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.2.6 Western blot檢測IRF5蛋白的表達(dá)：使用RIPA裂解腎組織，收集離心后的上清液，檢測蛋白濃度；制備12%聚丙烯酰胺分離膠和4%積層膠，樣品5×SDS上樣緩沖液，設(shè)置恒壓200 V，電泳60 min；設(shè)置恒壓100 V，濕法電轉(zhuǎn)移60 min；轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜經(jīng)5% TBST脫脂奶粉室溫封閉1 h；然后加IRF5一抗（1:1 000），于4 ℃搖床孵育過夜。隨后TBST清洗3次，加入二抗（1:5 000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST清洗3次，加入ECL發(fā)光液孵育膜5 min，暗室壓片曝光，顯影定影后膠片保存。蛋白表達(dá)量以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.2.7 qRT-PCR檢測炎癥基因mRNA表達(dá)：采用TRIzol法提取腎組織中的RNA，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參（由上海生工公司合成，見表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、2 μL引物（上、下游各1 μL，終濃度為200 nmol/L）、2 μL反應(yīng)緩沖液，以及1 μL待測樣品cDNA。PCR反應(yīng)體系為：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，反復(fù)40個(gè)循環(huán)。采用相對定量法計(jì)算得到數(shù)據(jù)，通過溶解曲線分析數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。相對表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct目的基因（待測樣品）-Ct內(nèi)參照（待測樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參照（校正樣品）]。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲除Nrf2加重UUO模型腎組織損傷和纖維化程度 PAS染色結(jié)果顯示，UUO組與假手術(shù)組相比，其腎小管明顯擴(kuò)張，間質(zhì)面積顯著增加，同時(shí)伴有炎癥性充血和水腫。Nrf2KOUUO組與Nrf2Wild-typeUUO組相比，其腎皮質(zhì)區(qū)域小管擴(kuò)增與間質(zhì)炎癥水腫更為明顯（P＜0.01），見圖1。Masson染色結(jié)果顯示，與Nrf2Wild-typeUUO組相比，Nrf2KOUUO組的腎組織膠原累積程度更為明顯（P＜0.05），見圖2。

2.2 敲除Nrf2加劇UUO模型腎組織CD68陽性的巨噬細(xì)胞浸潤 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與Sham組比，UUO組的CD68的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與Nrf2Wild-typeUUO組相比，Nrf2KOUUO組CD68的表達(dá)更為明顯（P＜0.05），見圖3。深入分析顯示，炎癥型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的表達(dá)在UUO中較Sham組高（P＜0.01）；與Nrf2Wild-typeUUO組比，Nrf2KOUUO組iNOS的表達(dá)水平更高（P＜0.05），見圖4。

2.3 敲除Nrf2提高UUO模型腎組織炎癥因子的釋放 qRT-PCR結(jié)果顯示，與Sham組相比，UUO組術(shù)后炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。深入分析顯示，Nrf2KOUUO組與Nrf2Wild-typeUUO組相比，腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)水平更高（P＜0.05）。見圖5。

2.4 敲除Nrf2促進(jìn)UUO模型腎組織IRF5的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與Sham組比，UUO組腎組織中IRF5的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001），與Nrf2Wild-typeUUO組比，Nrf2KOUUO組腎組織中IRF5的表達(dá)更為明顯（P＜0.01），見圖6。此外，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果同樣證實(shí)，敲除Nrf2提高了UUO模型腎組織IRF5的表達(dá)水平（P＜0.01），見圖7。

圖1 UUO模型中PAS染色顯示腎組織病理學(xué)改變（aP＜0.01）

圖2 UUO模型中Masson染色顯示腎組織膠原累積程度（aP＜0.05，bP＜0.01）

3 討論

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化作用與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。氧化應(yīng)激損傷常常直接或間接地引起腎內(nèi)不同類型細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致了包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)多種炎癥細(xì)胞的浸潤和活化，從而加劇局部損傷程度。在此過程中，抗氧化應(yīng)激信號可被激活，發(fā)揮拮抗氧化應(yīng)激損傷的作用。Nrf2/ARE通路是機(jī)體十分重要的抗氧化信號。本研究發(fā)現(xiàn)在UUO模型中，腎組織局部炎癥損傷和纖維化病變，同時(shí)也伴隨著Nrf2的活性明顯升高。有研究也證實(shí)，在腎損傷過程中，Nrf2/ARE信號可被反饋性地活化，參與腎組織損傷與修復(fù)[6]。靶向敲除Nrf2不僅加劇了局部的氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)也可推動(dòng)急性腎損傷向慢性腎纖維化轉(zhuǎn)變[7]。在缺血性腎損傷中，缺氧可誘導(dǎo)線粒體信號介導(dǎo)Nrf2水平下調(diào)，從而調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞中HIF-1α的活化[8]。一旦恢復(fù)氧供應(yīng)，Nrf2和HIF-1α相互作用，提供最佳的代謝方式，緩解局部氧化應(yīng)激損傷[8]。因此，基于Nrf2具有潛在的腎損傷保護(hù)作用，開發(fā)誘導(dǎo)Nrf2活化的治療藥物是當(dāng)下腎臟疾病新治療策略之一[9]。

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測UUO模型中CD68的表達(dá)（aP＜0.05，×400）

圖4 ELISA檢測UUO模型中iNOS的水平（aP＜0.05，bP＜0.01）

圖5 qRT-PCR檢測UUO模型中炎癥因子的釋放（aP＜0.05）

在UUO腎纖維化模型中我們注意到，Nrf2的活化與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥損傷同時(shí)存在。本課題組前期研究表明，促炎型巨噬細(xì)胞的浸潤與活化是推動(dòng)腎纖維化病變的重要誘因[10]。促炎型巨噬細(xì)胞可通過誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等炎癥因子的高表達(dá)，促進(jìn)腎組織炎癥損傷，同時(shí)也可通過釋放MMP-9等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化[11]。然而，Nrf2調(diào)控促炎型巨噬細(xì)胞活化的機(jī)制尚未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與Nrf2Wild-typeUUO組相比，Nrf2KOUUO組腎組織中CD68陽性的巨噬細(xì)胞的浸潤明顯增加，同時(shí)促炎型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的表達(dá)也明顯增加。上述結(jié)果提示：敲除Nrf2加劇UUO模型腎組織促炎型巨噬細(xì)胞的浸潤和活化。

通過進(jìn)一步研究，我們認(rèn)為敲除Nrf2誘導(dǎo)促炎型巨噬細(xì)胞活化的機(jī)制可能是通過上調(diào)IRF5表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。IRF5是維持巨噬細(xì)胞炎癥表型的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[12]。研究發(fā)現(xiàn)，IRF5可促進(jìn)Ly6C高表達(dá)的單核細(xì)胞分化為炎癥性CD11c+巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)了腸道炎癥[13]。脂多糖可通過IRF5的介導(dǎo)，誘導(dǎo)炎癥型巨噬細(xì)胞活化，并促進(jìn)TNF-α、IL-1β和IL-6等的釋放，引起神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。因此，IRF5可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的治療靶標(biāo)[14]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，與Nrf2Wild-typeUUO組相比，Nrf2KOUUO組腎組織中IRF5的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，同時(shí)，炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的合成與釋放也明顯升高。這些證據(jù)支持了敲除Nrf2基因通過誘導(dǎo)IRF5介導(dǎo)的炎癥型巨噬細(xì)胞活化，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)和釋放，加劇了UUO腎纖維化模型中的炎癥損傷作用。

圖6 Western blot檢測UUO模型中IRF5的表達(dá)（aP＜0.01）

圖7 免疫組織化學(xué)染色檢測UUO模型中IRF5的表達(dá)（aP＜0.05，bP＜0.01，×400）

本研究也存在一些不足之處，沒有通過免疫雙熒光染色技術(shù)，分別對Nrf2及IRF5與CD68進(jìn)行標(biāo)記，從而明確炎癥型巨噬細(xì)胞作為Nrf2的靶細(xì)胞及其IRF5的調(diào)控作用，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，在腎損傷與纖維化中，Nrf2基因敲除加劇UUO腎纖維化模型中的炎癥損傷作用。其機(jī)制可能與促進(jìn)IRF5介導(dǎo)的炎癥型巨噬細(xì)胞浸潤，進(jìn)而增加炎癥因子的合成與釋放有關(guān)。因此，Nrf2參與巨噬細(xì)胞活化機(jī)制的調(diào)控有助于從分子層面闡釋腎損傷與纖維化發(fā)生機(jī)制，同時(shí)也為腎損傷的臨床治療提供了一定的指導(dǎo)意義。