丁香微乳的質(zhì)量控制試驗(yàn)

何曉蓓，冉 洋，賀濤濤，范云鵬，麻武仁，劉迎秋，宋曉平

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

丁香為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)的干燥花蕾，溫中降逆，補(bǔ)腎壯陽(yáng)，主治胃寒嘔吐、肚脹、冷腸泄瀉、腎虛陽(yáng)痿[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，丁香具有抗氧化、殺菌、殺螨、解熱鎮(zhèn)痛等作用[2-3]。化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，丁香主要含丁香酚、石竹烯、α-葎草烯等成分[4]。阮娜等[5]從200味中藥提取物中發(fā)現(xiàn)丁香殺螨活性最為突出，其活性成分為丁香酚。郭超[6]將丁香提取物制成丁香微乳制劑。本試驗(yàn)采用薄層色譜法(TLC)對(duì)丁香微乳進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定丁香酚含量，旨為該制劑的質(zhì)量控制及進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 丁香提取物(丁香酚含量為58.70 mg/g)，實(shí)驗(yàn)室自制(批號(hào)：20170114)；丁香酚對(duì)照品(純度99.3%，批號(hào)：110725-201615)，丁香對(duì)照藥材(批號(hào)：121039-201405)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定所。

1.1.2 主要試劑 聚氧乙烯氫化蓖麻油40(RH40)，藥用輔料，批號(hào)：73870868E0，德國(guó)巴斯夫；油酸乙酯(EO)，藥用輔料，批號(hào):YO20170905，山東瑞生藥用輔料有限西安公司；丙二醇，藥用輔料，批號(hào)：20171002，江西益普生藥業(yè)有限公司；甲醇，色譜純，批號(hào)：20171223，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硅膠G薄層板(100 mm×100 mm)，批號(hào)：20170831，青島海洋化工有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 SP-20E型全自動(dòng)薄層色譜點(diǎn)樣儀，上海科哲生化科技有限公司；2F-8型暗箱四用紫外分析儀，上海勤科分析儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 丁香微乳的制備 稱取RH40 54 g、丙二醇18 g、EO8 g攪拌均勻作為丁香微乳的油相。向油相中加入丁香提取物2 g，攪拌均勻后3 000 r/min離心15 min，取上清液。稱取加提取物微乳油相 40 g， 逐滴加蒸餾水60 g，邊滴加邊攪拌即得[6]。

1.2.2 丁香微乳的鑒別 (1)對(duì)照品溶液的制備：參照《中國(guó)獸藥典》2015版二部中的方法，取丁香酚對(duì)照品，加乙醚制成每1 mL中含16 μL的溶液，作為丁香酚對(duì)照品溶液[1]。(2)對(duì)照藥材溶液的制備：參照《中國(guó)獸藥典》2015版二部中的方法，取丁香對(duì)照藥材粉末0.50 g置錐形瓶?jī)?nèi)，加5 mL乙醚，振搖1 min，過濾，濾液作為丁香對(duì)照藥材溶液[1]。(3)供試品溶液的制備：稱取丁香微乳20.02 g，加無水硫酸鈉2.01 g，超聲破乳30 min，加石油醚(30～60 ℃)20 mL萃取3次，合并石油醚萃取液層，室溫?fù)]干，加乙醚2 mL溶解即得[7]。(4)陰性對(duì)照溶液的制備：參照1.2.1項(xiàng)制備不含丁香提取物的空白微乳，參照1.2.2(3)項(xiàng)稱取空白微乳20.00 g，制成陰性對(duì)照溶液。(5)薄層色譜鑒別：丁香酚對(duì)照品、對(duì)照藥材溶液各5 μL，供試品、陰性對(duì)照溶液各10 μL， 分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)- 乙酸乙酯(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至105 ℃，置紫外燈(365 nm)下檢視。

1.2.3 丁香微乳的含量測(cè)定 (1)色譜條件:色譜柱為Welchrom C18(4.6 nm×250 nm，5 μm)，流速為 1 mL/min， 柱溫為40 ℃[8]，進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相為甲醇-水(55∶45)[9]，檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm。(2)對(duì)照品溶液的制備:精密稱定丁香酚對(duì)照品0.027 5 g，置于25 mL的容量瓶中，定容至刻度，制成含丁香酚1.100 0 mg/mL的丁香酚對(duì)照品溶液。(3)供試品溶液的制備：取丁香微乳約3 g，精密稱定，加入50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，過濾即得[10]。(4)陰性對(duì)照溶液的制備：參照1.2.1項(xiàng)制備不含丁香提取物的空白微乳，參照1.2.3(3)項(xiàng)制備陰性對(duì)照品溶液。(5)專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液20 μL， 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。(6)線性關(guān)系的考察：精密量取1.2.3(2)項(xiàng)制備的對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL和0.6 mL置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，并記錄峰面積。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。(7)精密度試驗(yàn)：精密吸取濃度為0.033 0 mg/mL的對(duì)照品溶液20 μL， 分別進(jìn)樣6次，記錄其峰面積并計(jì)算其RSD。(8)穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱定丁香微乳3.006 3 g制成供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h和24 h進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其RSD。(9)重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批丁香微乳，參照1.2.3(3)項(xiàng)平行制備6份供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其含量的RSD。(10)加樣回收率試驗(yàn)：分別取9份丁香微乳約1.5 g，精密稱定，分成3組，分別向每組中加入高、中、低3個(gè)濃度的丁香酚對(duì)照品溶液。分別進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率及其RSD。(11)含量測(cè)定：分別取3批丁香微乳約3 g，精密稱定，制成供試品溶液，每批檢測(cè)3次，計(jì)算丁香微乳中丁香酚含量。

2 結(jié)果

2.1 丁香微乳的鑒別 在紫外燈(365 nm)下，丁香微乳色譜中，在與對(duì)照藥材或丁香酚對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾(圖1)。

圖1 丁香微乳薄層色譜圖Fig.1 TLC of Caryophylli Flos microemulsion1:空白微乳； 2:丁香微乳； 3:丁香對(duì)照藥材； 4:丁香酚對(duì)照品1:Blank microemulsion; 2:Caryophylli Flos microemulsion;3:The control herbs of Caryophylli Flos; 4:Standard eugenol

2.2 丁香微乳的含量測(cè)定

2.2.1 專屬性試驗(yàn) 丁香微乳色譜峰中丁香酚與雜質(zhì)峰分離良好，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不小于3 000，空白微乳對(duì)丁香微乳中丁香酚的測(cè)定無干擾(圖2和圖3)。

圖2 丁香微乳高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of Caryophylli Flos microemulsion

圖3 空白微乳高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of blank microemulsion

2.2.2 線性關(guān)系的考察 丁香酚在濃度0.011 0～0.066 0 mg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=1.000 0)，線性擬合回歸方程為y=22 545 602.597 4x+30 256.800 0(圖4)。

圖4 丁香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The calibration curve of eugenol

2.2.3 精密度試驗(yàn) 濃度為0.033 0 mg/mL的丁香酚對(duì)照品溶液，6次的峰面積分別為770 800、771 293、771 073、774 662、778 299和779 222，RSD為0.49%。說明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 丁香微乳溶液在0、2、4、6、8、12 h和24 h的峰面積分別為707 159、706 377、706 552、709 760、706 634、706 508和705 193，RSD為0.20%。說明丁香微乳溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 在丁香微乳重復(fù)性試驗(yàn)中，峰面積的RSD=0.56%(表1)，說明重復(fù)性良好。

表1 丁香微乳重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The repeatability test results of Caryophylli Fols microemulsion

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 丁香微乳劑加樣回收率試驗(yàn)中所測(cè)丁香酚的平均回收率是100.60%，其RSD=1.00%(表2)，說明準(zhǔn)確性高。

表2 丁香微乳加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The recovery test results of Caryophylli Fols microemulsion

2.2.7 含量測(cè)定 丁香微乳中丁香酚含量3次測(cè)定結(jié)果分別為0.05%、0.049%、0.05%(表3)，平均含量為0.049 7%。

表3 丁香微乳中丁香酚含量檢測(cè)結(jié)果Table 3 The determination results of eugenol content in Caryophylli Flos microemulsion

3 討論

3.1 關(guān)于丁香微乳的薄層色譜鑒別 采用薄層色譜法鑒別中藥制劑時(shí)，樣品的制備和展開劑的選擇對(duì)待測(cè)斑點(diǎn)的集中性與其他斑點(diǎn)的分離度起重要作用[11]。本試驗(yàn)在丁香微乳的薄層色譜鑒別中，參照戴建鋒[7]樣品前處理方法，將無水硫酸鈉加入丁香微乳中，超聲破乳，石油醚進(jìn)行萃取，揮干石油醚，再加乙醚進(jìn)行溶解。根據(jù)薄層色譜的分析技術(shù)原理[12]，本試驗(yàn)所用展開劑，通過調(diào)節(jié)石油醚與乙酸乙酯的比例來改變展開劑的極性，在2015版獸藥典的展開劑的基礎(chǔ)上，增大展開劑的極性，最終確定使用石油醚(60～90 ℃)∶乙酸乙酯=5∶1作為丁香微乳薄層色譜鑒別的展開劑，丁香酚與相鄰物質(zhì)的分離度更高，且斑點(diǎn)位于薄板中間位置，與丁香酚對(duì)照品相同位置處斑點(diǎn)清晰可見，且空白微乳無干擾。

3.2 關(guān)于丁香微乳的含量測(cè)定 中國(guó)獸藥典2015版二部采用氣相色譜法對(duì)丁香藥材中丁香酚含量進(jìn)行測(cè)定[1]，而高效液相色譜法(HPLC)在中藥成分含量測(cè)定中逐漸得以廣泛應(yīng)用。黎迎等[11]以甲醇-1%醋酸水(55∶45)為流動(dòng)相，采用HPLC對(duì)丁香藥材中丁香酚進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果表明HPLC法測(cè)定丁香中丁香酚的含量高于藥典氣相色譜法。陳岳蓉等[13]也采用HPLC測(cè)定了藏藥七味訶子散中有效成分丁香酚的含量。本試驗(yàn)采用Welchrom C18色譜柱(4.6 nm×250 nm，5 μm)，以甲醇-水(55∶45)為流動(dòng)相對(duì)丁香微乳中丁香酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，丁香酚在0.011 0～0.066 0 mg/mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系(r=1.000 0)，平均回收率100.60%，RSD=0.99%。說明所建立方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定準(zhǔn)確。