脂多糖致小鼠急性肺損傷模型給藥劑量和時(shí)間的篩選

王顯峰，白薩日娜

(1.扎蘭屯職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 扎蘭屯 162650 ； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是指各種直接或間接因素所致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大量蛋白液積聚造成急性肺水腫，導(dǎo)致嚴(yán)重的急性呼吸衰竭，影像學(xué)表現(xiàn)是兩肺滲出性病變，氧合指數(shù)<300[1]。急性肺炎是肺炎、敗血癥、創(chuàng)傷等引起的肺部炎癥之一，在ALI中，中性粒細(xì)胞是炎癥和發(fā)病機(jī)理的主要參與者，因此，當(dāng)肺臟發(fā)生炎性病變時(shí)，外周血中大量的白細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞會(huì)聚集在患病部位，在肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和病理組織樣本中有大量的多形核中性粒細(xì)胞，而外周血中的中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear，PMN)減少[2]。國(guó)內(nèi)外研究人員一般采用氣管滴入或腹腔注射脂多糖制造小鼠急性肺損傷模型[3-4]，本試驗(yàn)采用了對(duì)小鼠創(chuàng)傷較小的滴鼻方式，系統(tǒng)地比較了不同時(shí)間、不同脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)濃度的最適造模條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)選用清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，48只，6～8周齡，18～22 g，由內(nèi)蒙古大學(xué)國(guó)家清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育室提供。

1.2 試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì) 小鼠試驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。將小鼠隨機(jī)分成8組，每組6只，分別為造模劑量組、造模時(shí)間組和空白對(duì)照組(Control)。造模劑量組每只小鼠滴鼻劑量分別為1、2 mg/(kg·bw)和5 mg/(kg·bw)的脂多糖，滴鼻6 h后取樣。造模時(shí)間組分別于滴鼻后6、12、24 h和48 h進(jìn)行取樣，給藥劑量均為2 mg/(kg·bw)?？瞻讓?duì)照組小鼠滴鼻等體積0.9%NaCl。試驗(yàn)分別取每組每只小鼠肺灌洗液用來(lái)檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β含量，取小鼠外周血鏡下計(jì)算中性粒細(xì)胞數(shù)量，取左肺計(jì)算濕干重比，取右肺做病理切片。

1.3 試驗(yàn)材料 脂多糖LPS(46M4045V)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；酶標(biāo)板，購(gòu)自美國(guó)康寧有限公司；蘇木素-伊紅染液及其他試劑，均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

1.4 肺組織切片及蘇木精-伊紅染色 取部分小鼠右肺組織，置入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定12 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，以中性樹(shù)膠封片。

1.5 肺濕干重比計(jì)算 取完整小鼠左肺，用濾紙吸取肺組織表面的血液，干燥稱(chēng)量紙上稱(chēng)得濕重(W)，置72 ℃恒溫箱，烘烤48 h后稱(chēng)量干重(D)，以濕干重比(W/D)表示肺組織含水量。

1.6 細(xì)胞因子的測(cè)定 采用ELISA方法測(cè)定小鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，在吸光度560 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)其含量，記錄數(shù)據(jù)。

1.7 中性粒細(xì)胞(PMN)百分比 取適量小鼠外周血，做血涂片后用瑞氏-吉姆薩染色液染色，晾干后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，中性粒細(xì)胞百分比(PMN%)=中性粒細(xì)胞總數(shù)/白細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有數(shù)據(jù)需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臨床癥狀 本試驗(yàn)?zāi)Ｐ透鹘M小鼠均出現(xiàn)明顯精神沉郁，食欲減退現(xiàn)象。其中造模6 h、9 h組和給藥劑量1、2、5 mg/(kg·bw)組小鼠出現(xiàn)群聚，個(gè)別小鼠出現(xiàn)呼吸頻率增加，尤其是5 mg/(kg·bw) 組小鼠呈現(xiàn)精神萎靡，團(tuán)索一起，飲食廢絕，體重明顯減輕；12 h組小鼠后期基本恢復(fù)正常。

2.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 如中插彩板圖1所示，從病理切片結(jié)果顯示，按炎癥分級(jí)情況進(jìn)行病理學(xué)評(píng)定：空白對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)完整，肺泡壁薄，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物，肺泡結(jié)構(gòu)完整(封底彩版圖1A)；3、6、9 h組和12 h組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度模糊，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞增多，肺泡間隔明顯增厚，肺部炎癥明顯(封底彩版圖1B、1C、1D、1E箭頭)，尤其以6 h組和9 h 組最嚴(yán)重(封底彩版圖1C、1D)；1 mg/(kg·bw)組肺部炎癥程度較輕，見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管結(jié)構(gòu)完整，支氣管黏膜下無(wú)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(封底彩版圖1F箭頭)；2、5 mg/(kg·bw)組肺部炎癥較明顯(封底彩版圖1G和1H箭頭)。

圖1 小鼠肺臟組織病理學(xué)檢測(cè) (H.E.染色，100×)Fig.1 Mice lung tissues detected by histopathology (H.E. staining,100×)A：空白對(duì)照組； B：3 h組； C：6 h 組； D：9 h 組； E:12 h 組； F：1 mg/(kg·bw)組； G：2 mg/(kg·bw)組； H：5 mg/(kg·bw)組A:Blank control group; B:3 h group; C:6 h group; D:9 h group; E:12 h group; F:1 mg/(kg·bw) group;G:2 mg/(kg·bw) group; H:5 mg/(kg·bw) group

2.3 肺組織濕干重比 造模時(shí)間組小鼠于滴藥后3、6、9 h和12 h肺組織濕干重比明顯高于空白對(duì)照組，其中6 h組小鼠肺組織濕干重比顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。2、5 mg/(kg·bw)組小鼠肺組織濕干重比極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 小鼠急性肺損傷不同造模時(shí)間肺濕干重比Table 1 Lung wet and dry weight ratio of mice with acute lung injury at different modeling times

表2 不同造模濃度肺濕干重比Table 2 Lung wet and dry weight ratio at different modeling concentrations

2.4 急性肺損傷模型時(shí)間及濃度篩選 造模時(shí)間組小鼠滴藥后6、9 h和12 h肺組織IL-6、TNF-α和IL-1β水平極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，其中6 h組肺組織IL-6、TNF-α和IL-1β水平高于其他各組，如表3所示。脂多糖2、5 mg/(kg·bw)組小鼠肺組織IL-6、TNF-α和IL-1β水平極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，如表4所示。

表3 不同造模時(shí)間細(xì)胞因子的表達(dá)水平Table 3 The expression level of cytokines at different modeling times

表4 不同造模濃度細(xì)胞因子的表達(dá)水平Table 4 The expression level of cytokines at different modeling concentrations

2.5 中性粒細(xì)胞百分比 中性粒細(xì)胞百分比結(jié)果見(jiàn)表5和表6。造模時(shí)間各組PMN百分比均明顯低于空白對(duì)照組，其中3 h組PMN百分比顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，6、9 h組和12 h組PMN百分比極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，如表5所示。造模濃度各組PMN百分比均明顯低于空白對(duì)照組，其中1 mg/(kg·bw)組PMN百分比顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，2、5 mg/(kg·bw)組PMN百分比極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，如表6所示。

表5 不同造模時(shí)間PMN百分比Table 5 PMN percentages at different modeling times

表6 不同造模濃度PMN百分比Table 6 PMN percentages at different modeling concentrations

3 討論

急性肺損傷(ALI)致病因素較多，其致死率頗高，但目前臨床上特效藥較少，其發(fā)病機(jī)制也尚未明確。目前小鼠、大鼠是研究ALI最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[5]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的一種成份，只有在細(xì)菌死亡、繁殖或人工破壞時(shí)，才會(huì)釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮其各種效應(yīng)。由于脂多糖對(duì)宿主有一定的毒性，因此，也叫做內(nèi)毒素，在科學(xué)研究上常作為誘導(dǎo)物，用于小鼠、大鼠急性肺炎模型的建立[6-7]。臨床上常用尾靜脈注射藥物、腹腔注射藥物、氣管滴入藥物以及盲腸結(jié)扎穿刺方法建立急性肺損傷模型，王婷等[8]通過(guò)試驗(yàn)比較上述幾種方法發(fā)現(xiàn)，腹腔注射藥物和氣管滴入更適合ALI模型的建立。本試驗(yàn)采用對(duì)動(dòng)物機(jī)體刺激較小的氣管滴入方法，在此基礎(chǔ)上改進(jìn)具體滴藥模式，將滴入劑量分3次滴入發(fā)現(xiàn)效果更好。據(jù)現(xiàn)有關(guān)于ALI模型條件篩選的報(bào)道，筆者發(fā)現(xiàn)部分學(xué)者只篩選時(shí)間[9]，對(duì)于單獨(dú)篩選LPS濃度的研究未見(jiàn)報(bào)道，目前臨床常用LPS造模濃度為10[10]、5 mg/(kg·bw)[11]和2 mg/(kg·bw)[12]。本試驗(yàn)在各種因素相同條件下同時(shí)造模篩選時(shí)間和LPS濃度，更加符合ALI模型建立的實(shí)際情況。

本試驗(yàn)采用鼻孔滴注方法，設(shè)置了造模劑量組[1、2 mg/(kg·bw)和5 mg/(kg·bw)]和造模時(shí)間組(3、6、9 h和12 h)旨在建立小鼠ALI模型最佳條件，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定ALI的典型指標(biāo)，病理組織變化、肺干濕重、炎癥因子水平，來(lái)綜合評(píng)價(jià)ALI模型是否成功。試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)LPS濃度為2 mg/(kg·bw)， 造模時(shí)間為6 h時(shí)，炎癥因子表達(dá)量最高且肺濕干重比最明顯，中性粒細(xì)胞也極顯著減少，小鼠肺臟病理切片可見(jiàn)明顯炎性病變，視為最佳造模條件。盡管LPS造模9 h、濃度5 mg/(kg·bw) 炎癥因子表達(dá)量、肺濕干重比、PMN百分比等指標(biāo)與空白對(duì)照組相比也有顯著差異，但綜合小鼠臨床狀態(tài)表現(xiàn)，上述條件不適合作為ALI模型的最佳條件。