吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定及敏感藥物篩選

郝景鋒，李高謙，張宇航，王永生，付連軍，劉立明

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101 ； 2. 阿勒泰職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿勒泰 836000 ; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)院，吉林 長春 132118)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是子宮黏膜表面及深層組織發(fā)生的炎性疾病[1]，是奶牛常見病、多發(fā)性疾病，對奶牛健康養(yǎng)殖危害巨大，不僅影響奶牛正常的生理功能，還會導(dǎo)致奶牛長期不孕，甚至造成終生不育而提早淘汰[2]，其與奶牛乳房炎、蹄葉炎并列成為制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。奶牛子宮內(nèi)膜炎治療產(chǎn)生大量費用，易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致藥物殘留影響牛奶、牛肉等動物性食品安全[3]，我國奶牛存欄量1 440萬頭[4]，吉林地區(qū)奶牛養(yǎng)殖量較大，奶牛子宮內(nèi)膜炎防控問題較為突出，本課題組擬對吉林地區(qū)多個大型奶牛場120頭患病奶牛子宮內(nèi)容物進行細菌分離與鑒定，并對其主要致病菌進行敏感藥物篩選試驗，以期為科學(xué)、合理治療吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗對象 患病奶牛選自吉林地區(qū)多個奶牛養(yǎng)殖場120頭患子宮內(nèi)膜炎奶牛，采用子宮內(nèi)容物采樣器(專利號:ZL201420335941.6)無菌采集子宮內(nèi)容物。

1.2 試驗器材與試劑

1.2.1 常規(guī)培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉血培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，以上各培養(yǎng)基采用常規(guī)方法配制。

1.2.2 細菌鑒定生化管 生化鑒定用微量發(fā)酵管，購自上海魯微科技有限公司。

1.2.3 藥敏紙片 頭孢噻呋鈉、頭孢噻肟、呱拉西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、青霉素G、氨芐西林、頭孢西汀、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、克林霉素、阿莫西林、氟哌酸、恩諾沙星、強力霉素、卡拉霉素、氧氟沙星等藥敏紙片，均購自杭州微生物制劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備 參照《獸醫(yī)微生物學(xué)》第5版[5]教材進行。

1.3.2 樣品采集 奶牛子宮內(nèi)膜炎患牛子宮內(nèi)容物樣品120份，采自吉林地區(qū)多個大型奶牛場?；寂１６ê笄謇硭藜S，以1%新潔爾滅溶液清洗外陰部[6]，采用直腸把握法向子宮內(nèi)插入子宮內(nèi)容物采樣器采集子宮內(nèi)分泌物黏液，注入無菌處理的離心管內(nèi)并編號，置于冰盒中送至實驗室待檢。

1.3.3 細菌分離純化培養(yǎng) 生理鹽水稀釋子宮內(nèi)容物[7]，將稀釋好的病料分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉血培養(yǎng)基等各種培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃溫箱內(nèi)過夜，培養(yǎng)24 h，取出觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、是否溶血以及顏色特點分類純培養(yǎng)，純化后置于20%甘油的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.4 細菌鑒定 應(yīng)用生化方法分類鑒定已純化處理的待檢致病菌，應(yīng)用V-P、MR、觸酶、凝固酶、麥芽糖氧化酶、尿素、甘露醇、葡萄糖、堿性磷酸酶、明膠液化等生化方法鑒定疑似葡萄球菌科致病菌；應(yīng)用吲哚、甲基紅、V-P、枸櫞酸、乳糖、麥芽糖、蔗糖、尿素、間肌醇、蕈糖等生化方法鑒定疑似腸桿菌科致病菌；應(yīng)用觸酶、6.5%氯化鈉、馬尿酸鈉、環(huán)腺苷-磷酸(CAMP)、甘露醇、棉子糖、山梨醇、七葉苷、乳糖、葡萄糖、水楊苷蕈糖、菊糖、淀粉等生化方法鑒定疑似鏈球菌屬致病菌。

1.3.5 敏感藥物篩選 藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法[8]，選用頭孢噻呋鈉、慶大霉素、環(huán)丙沙星、青霉素G、氨芐西林、阿莫西林等藥敏紙片，接種各已檢致病菌于37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h后觀察試驗結(jié)果，測定抑菌圈平均直徑，抑菌效果判定：敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)，參考美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的標準。

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果采用5次試驗的平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果

2.1 樣品中致病菌分離及鑒定 從120份奶牛子宮內(nèi)容物樣品中分離出211株細菌，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化膿鏈球菌、綠膿桿菌、蠟樣芽胞桿菌以及化膿放線菌等。結(jié)果見表1，大腸桿菌68株，占32.23%；金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌分別為26、14株，各占12.32%、6.64%；化膿鏈球菌49株，占23.22%；蠟樣芽胞桿菌37株，占17.54%；綠膿桿菌10株，占4.74%；化膿放線菌7株，占3.32%?？梢姶竽c桿菌、葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌為吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌，從感染類型上來看，單一感染占44.35%；雙重致病菌感染占41.74%；三重致病菌感染占13.91%。單一感染中大腸桿菌以及蠟樣芽胞桿菌為主要致病菌；雙重感染中大腸桿菌與化膿鏈球菌為主要致病菌；三重感染中大腸桿菌+金黃色葡萄球菌+蠟樣芽胞桿菌以及大腸桿菌+表皮葡萄球菌+ 化膿鏈球菌均為優(yōu)勢致病菌，結(jié)果見表2。

表1 吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌檢測結(jié)果Table 1 Detection results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis in Jilin area

表2 吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌感染類型檢測結(jié)果Table 2 Detection results of pathogenic bacteria infection types of dairy cow endometritis in Jilin area

2.2 敏感藥物篩選試驗 選用頭孢噻呋鈉、四環(huán)素以及恩諾沙星等19種藥物對檢測出的大腸桿菌等5種主要致病菌進行敏感藥物篩選試驗，結(jié)果見表3，由表3可知，各種致病菌對頭孢噻呋鈉、頭孢噻肟、呱拉西林素、頭孢西汀、鏈霉素以及卡那霉素均產(chǎn)生較強的耐藥性；而四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、恩諾沙星以及氧氟沙星等對各種致病菌均有較強的抑菌作用，因此治療吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的優(yōu)選藥物為四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、恩諾沙星以及氧氟沙星等。

表3 不同藥物對各種致病菌的平均抑菌直徑Table 3 Average bacteriostatic diameter of different drugs to various pathogenic bacteria (mm)

3 討論

本試驗檢測了來自吉林地區(qū)不同規(guī)模的奶牛養(yǎng)殖場120頭奶牛，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化鑒定分離出大腸桿菌以及蠟樣芽胞桿菌等7種致病菌，共計211株致病菌，其中大腸桿菌所占32.23%，化膿鏈球菌所占23.22%，葡萄球菌所占18.96%，蠟樣芽胞桿菌所占17.54%，感染類型中單一感染占44.35%，雙重感染占41.74%。黃啟震等[9]通過研究證實，赤峰、重慶、張家口以及濰坊等地奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌依次為葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌以及鏈球菌；而寶雞地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌為葡萄球菌；北京奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為蠟樣芽孢桿菌。王京仁等[10]研究發(fā)現(xiàn)，常德地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌病例25頭患牛主要菌株的檢出率依次為大腸桿菌11株(44.00%)、葡萄球菌屬7株(28.00%)、鏈球菌5株(20.00%)。劉長彬等[11]研究證實，來自石河子墾區(qū)206份樣品中分離出8種病原菌共408株，其中葡萄球菌198株(占48.53%)、鏈球菌109株(占25.49%)、大腸桿菌85株 (占20.83%)。趙清梅等[12]調(diào)查了寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌，研究證實單一感染與混合感染分別各占42.31%以及52.56%。以上研究均與本試驗趨勢一致，亦證實了奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌為大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌，所占比例基本一致，大腸桿菌等致病菌均為環(huán)境常見菌，證實環(huán)境因素為奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的重要因素，飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境消毒能力、奶牛產(chǎn)科疾病治療水平、免疫水平等因素均與奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病關(guān)系密切。

辛萍萍等[13]對濰坊地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌進行藥敏試驗證實，頭孢拉定、環(huán)丙沙星、恩諾沙星抗菌效果良好，這與本試驗結(jié)果十分接近。趙鑫[14]研究證實，大腸桿菌對阿莫西林、恩諾沙星、頭孢噻肟敏感，葡萄球菌對阿莫西林、頭孢噻肟、四環(huán)素較敏感，鏈球菌對阿莫西林、頭孢噻肟、恩諾沙星敏感，這與本試驗藥物敏感趨勢一致。青霉素G、頭孢噻呋鈉、頭孢西汀、鏈霉素、卡那霉素以及呱拉西林這幾種藥物對大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌抑菌效果均不好，可能與長期使用該藥而產(chǎn)生的耐藥性有關(guān)，也可能與季節(jié)、環(huán)境等因素有關(guān)，大量使用這些藥物使機體產(chǎn)生抗藥性，不科學(xué)的治療會使該病治療形成惡性循環(huán)，無法根治。而且化學(xué)藥物殘留嚴重影響乳以及肉的品質(zhì)，食品安全受到前所未有的挑戰(zhàn)，嚴重危害人類健康。孟彥軍[15]研究證實，引起隴西縣奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌對氨芐青霉素、鏈霉素、青霉素G等藥物具有耐藥性，試驗證實，恩諾沙星、環(huán)丙沙星以及四環(huán)素對以上致病菌抑菌效果良好，可以作為治療首選藥物。大量研究證實，抗生素在治療奶牛子宮內(nèi)膜炎中發(fā)揮了重要作用，但一定要注意耐藥性問題、藥物殘留問題、動物性食品安全問題等，因此較為有效的方法是科學(xué)有效分離致病菌，篩選敏感藥物科學(xué)治療乃為上策。本試驗成功分離出吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌，單一感染、雙重感染所占比例分別為44.35%以及41.74%，三重感染所占比例為13.91%；通過敏感藥物篩選頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、阿莫西林、恩諾沙星以及氧氟沙星均顯示出較好的抑菌效果，可以作為吉林地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎治療的備選藥物。