2株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定與S1、M和N基因序列分析

何家輝，封柯宇，李鴻鑫，宋才良，張鈺坤，謝青梅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病。IBV主要通過(guò)空氣傳播，也可以通過(guò)飼料接觸等方式間接傳播，主要侵害呼吸道、生殖道以及消化道，表現(xiàn)為打噴嚏、流鼻液、氣管啰音和出血、腎臟腫大和尿酸鹽沉積、腺胃病變等癥狀，致使雞群生產(chǎn)性能下降，產(chǎn)蛋量下降，蛋品質(zhì)降低，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的危害和較大的損失。IBV是單股正鏈RNA病毒，基因組RNA與核蛋白(N)結(jié)合，被包裹在包含纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)和小囊膜蛋白(E)的脂質(zhì)囊膜中[1]。由S基因編碼的纖突蛋白位于病毒囊膜上的棒狀纖突結(jié)構(gòu)中，用于識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞相關(guān)受體，并激活病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜的融合，從而將病毒基因釋放至宿主細(xì)胞中。纖突蛋白S存在堿性氨基酸裂解位點(diǎn)，可被特異性酶切成S1和S2亞基[2-3]。S基因編碼的蛋白是IBV中最重要的保護(hù)性抗原，其中S1亞基的核苷酸序列是IBV分型的主要依據(jù)[4-5]。M基因編碼的膜蛋白是IBV中含量最多的一種跨膜糖蛋白，在病毒復(fù)制過(guò)程中意義重大，M基因的變異對(duì)病毒從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜出芽能力、病毒組裝能力影響顯著[6-7]。N基因編碼的核衣殼蛋白是一種結(jié)合在病毒基因組RNA上的堿性磷酸化蛋白，形成螺旋狀的核糖核蛋白復(fù)合體[8]。N蛋白突變會(huì)影響病毒的復(fù)制和組裝，同時(shí)改變保護(hù)性。

IB 防控的最大難點(diǎn)在于其分支眾多，且不同分支之間的交叉保護(hù)力較弱。當(dāng)前使用的疫苗株多為Mass型毒株，與流行毒株差異較遠(yuǎn)，雞場(chǎng)免疫防控壓力較大。頻繁地使用疫苗加劇了野毒株的變異壓力，增多病毒變異的機(jī)會(huì)，使其能夠產(chǎn)生新的基因型，從而加快病毒進(jìn)化，不斷加大對(duì)IB的防控難度[4,9]。本試驗(yàn)從廣東兩地發(fā)病雞群中分離得到了IBV，并對(duì)其S1、M和N基因進(jìn)行分析，為雞傳染性支氣管炎的研究及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料與SPF雞胚 病料分別來(lái)自2019年11月廣東清遠(yuǎn)某雞場(chǎng)發(fā)病雞群和2019年12月廣東惠州某雞場(chǎng)發(fā)病雞群，病雞臨床表現(xiàn)為腎臟腫大、尿酸鹽沉積、“花斑腎”等典型癥狀，均疑似感染傳染性支氣管炎。2個(gè)雞場(chǎng)均按規(guī)定的免疫程序接種過(guò)Mass型H120疫苗。SPF雞胚，購(gòu)自廣東新興大華農(nóng)禽蛋有限公司SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 引物和主要試劑 擴(kuò)增S1基因采用Feng等[10]設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增M基因和N基因采用自行設(shè)計(jì)的引物。引物信息見(jiàn)表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。克隆pMD-19T載體、DL-2 000 DNA marker，均購(gòu)自TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；病毒RNA/DNA提取試劑盒，購(gòu)自Axygen公司；一步法RT-PCR試劑盒，購(gòu)自Vazyme公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒，均購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

表1 IBV S1、M和N基因擴(kuò)增引物Table 1 Primer for IBV S1,M and N gene

1.3 病毒分離 在病雞瀕死狀態(tài)下取其腎臟、肺臟、肝臟、氣管等組織，迅速轉(zhuǎn)移至研缽，加入液氮研磨至均質(zhì)，加雙抗(含有青霉素2 000 U/mL、鏈霉素1 000 μg/mL的PBS)混勻，-80 ℃反復(fù)凍融3次，5 000 g離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，接10日齡SPF雞胚尿囊腔，37 ℃培養(yǎng)48 h，盲傳3代后收集尿囊液，保存至-80 ℃。

1.4 分離株半數(shù)感染量(EID50)測(cè)定 將收集到的尿囊液用生理鹽水倍比稀釋為10-4～10-8共5個(gè)梯度，每個(gè)梯度接種5個(gè)大小一致的10日齡SPF雞胚，每個(gè)雞胚接種100 μL稀釋后的尿囊液，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。棄去接種后24 h內(nèi)的死胚，每日觀察雞胚病變死亡情況并記錄，直至7 d后取出胚體，觀察雞胚病變情況。若雞胚表現(xiàn)為死亡、卷曲、發(fā)育遲緩，均判斷雞胚感染了IBV，并使用Reed-Muench 二氏法[11]計(jì)算病毒的 EID50。

1.5 RNA提取與S1、M和N基因擴(kuò)增 按照病毒RNA/DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提收集到的尿囊液核酸，使用一步法RT-PCR試劑盒及對(duì)應(yīng)引物擴(kuò)增基因，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)條帶正確后進(jìn)行膠回收，連接載體并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇后涂布至LA平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取中等大小的單克隆菌落擴(kuò)搖后，用M13-F/R通用引物進(jìn)行菌液PCR。挑選陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行擴(kuò)搖和抽提質(zhì)粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6S1、M和N基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列分析 對(duì)分離株S1、M和N基因使用DNASTAR 7.1程序與5株國(guó)內(nèi)常用IBV疫苗株S1、M和N基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析，疫苗株信息見(jiàn)表2。使用MEGA-X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，參考序列為5株IBV疫苗株S1、M和N基因核苷酸序列和若干株GenBank公布的具有代表性毒株的S1、M和N基因核苷酸序列。

表2 IBV疫苗株Table 2 IBV vaccine strains

2 結(jié)果

2.1 病毒分離及EID50測(cè)定 雞胚接種2種病料研磨液后均表現(xiàn)為羊膜變厚、尿囊液渾濁，并出現(xiàn)卷曲、發(fā)育遲緩、彌漫性出血和死亡。清遠(yuǎn)分離株EID50測(cè)定結(jié)果為10-7.5/0.1 mL，惠州分離株離株EID50測(cè)定結(jié)果為10-6.75/0.1 mL。

2.2 目的基因的擴(kuò)增和測(cè)序 經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到2個(gè)分離株的S1、M和N基因，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別在1 700、740 bp和1 300 bp處出現(xiàn)與預(yù)期相符的特異性條帶。將其送測(cè)序，結(jié)果上傳至GenBank，登錄號(hào)如表3所示。將清遠(yuǎn)分離株命名為CK/CH/GD/QY1119，將惠州分離株命名為CK/CH/GD/HZ1225。

表3 分離株S1、M和N基因GenBank登錄號(hào)Table 3 GenBank registration number of isolates S1,M and N gene

2.3S1基因分析

2.3.1S1基因核苷酸序列分析 2個(gè)分離株的S1基因長(zhǎng)度均為1 620 bp，序列間同源性為84.8%。CK/CH/GD/QY1119的S1基因序列與5株 疫苗株同源性在78.7%～97.4%，其中與LDT3疫苗株同源性最高，達(dá)到了97.4%，與H120等常用疫苗株同源性較低，在78.7%～81.7%。CK/CH/GD/HZ1225的S1基因序列與5株疫苗株同源性均較低，在77.3%～84.3%。將2個(gè)分離株S1基因序列與27株參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示，分離株序列與參考序列構(gòu)成6個(gè)分支，可分為4/91型、LDT3型、QX型、TWⅠ型、TWⅡ型和Mass型。分離株CK/CH/GD/QY1119屬于以tl/CH/LDT3/03(KT852992)為代表的LDT3型分支，分離株CK/CH/GD/HZ1225屬于以QXIBV(AF193423)為代表的QX型分支，2個(gè)分離株與國(guó)內(nèi)常用的以H120為代表的Mass型疫苗株進(jìn)化距離均較遠(yuǎn)。

圖1 IBV S1、M和N基因進(jìn)化樹(shù)Fig.1 IBV S1,M and N gene phylogenetic tree●: 本試驗(yàn)分離菌●: Strains isolated in this test

2.3.2S1基因推導(dǎo)氨基酸序列分析 CK/CH/GD/QY1119的S1基因推導(dǎo)氨基酸序列與5株疫苗株相比，同源性在75.7%～95.9%，其中與LDT3疫苗株同源性最高，達(dá)到了95.9%，與H120等常用疫苗株同源性較低，在75.7%～80.8%，將其與H120疫苗株相比，差異主要在第63～133、273～331、368～394位和第443～484位。CK/CH/GD/HZ1225的S1基因推導(dǎo)氨基酸序列與5株疫苗株相比同源性較低，在75.4%～83.7%，將其與H120疫苗株相比，差異主要在第63～132、252～295、379～394位和第432～483位。值得注意的是，2個(gè)分離株均在第24位和第121、122位存在氨基酸的插入，見(jiàn)圖2。

圖2 2個(gè)分離株與H120株S1基因推導(dǎo)氨基酸序列的比較Fig.2 Comparison of amino acid sequences of S1 gene between the two isolates and H120 strains

2.4M基因分析

2.4.1M基因核苷酸序列分析 CK/CH/GD/QY1119和CK/CH/GD/HZ1225的M基因長(zhǎng)度分別為675 bp和681 bp，序列間同源性為90.9%。CK/CH/GD/QY1119的M基因序列與5株疫苗株同源性在90.0%～91.3%。CK/CH/GD/HZ1225的M基因序列與5株疫苗株同源性在88.8%～92.5%。將2個(gè)分離株的M基因序列與27株參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示，分離株序列與參考序列構(gòu)成6個(gè)進(jìn)化群。CK/CH/GD/QY1119與YX10等毒株分布在一個(gè)進(jìn)化群，而未與LDT3等毒株分布在一個(gè)進(jìn)化群。CK/CH/GD/HZ1225與QX型代表毒株QXIBV分布在一個(gè)進(jìn)化群，與S1基因進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致。

2.4.2M基因推導(dǎo)氨基酸序列分析 CK/CH/GD/QY1119的M基因推導(dǎo)氨基酸序列與5株疫苗株同源性在93.7%～95.1%，與H120疫苗株相比，差異在第12、15、16、17、46、79、91、94位和第188位，共9個(gè)氨基酸，其中在第221位存在氨基酸缺失，如圖3所示。CK/CH/GD/HZ1225的M基因推導(dǎo)氨基酸序列與5株疫苗株同源性在90.3%～92.9%，與H120疫苗株相比，差異在第5、6、11、12、15、17、36、46、54、58、72、92、102、150、189、213位和第223位，共17個(gè)氨基酸，其中在第4位存在氨基酸的插入，如圖3所示。

圖3 2個(gè)分離株與H120株M基因推導(dǎo)氨基酸序列比較Fig.3 Comparison of amino acid sequences of M gene between the two isolates and H120 strains

2.5N基因分析

2.5.1N基因核苷酸序列分析 2個(gè)分離株N基因長(zhǎng)度均為1 230 bp，序列間同源性為94.8%。CK/CH/GD/QY1119的N基因序列與5株疫苗株同源性在86.6%～93.7%，與LDT3型疫苗株同源性最高，達(dá)到了93.7%，與H120等常用疫苗株同源性較低，在86.6%～87.8%。CK/CH/GD/HZ1225的N基因序列與5株疫苗株同源性在87.5%～94.0%，與LDT3型疫苗株同源性最高，達(dá)到了94.0%，與H120等常用疫苗株同源性較低，在87.0%～87.7%。將2個(gè)分離株的N基因序列與25株參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1所示，分離株序列與參考序列構(gòu)成6個(gè)進(jìn)化群，2個(gè)分離株與LDT3疫苗株位于同一進(jìn)化群，進(jìn)化距離相近。

2.5.2N基因推導(dǎo)氨基酸序列分析 CK/CH/GD/QY1119的N基因推導(dǎo)氨基酸序列與5株疫苗株同源性在90.0%～95.1%，與H120疫苗株相比，差異主要在第6～22、209～248位和第334～366位，共38個(gè)氨基酸，無(wú)氨基酸的插入和缺失。CK/CH/GD/HZ1225的N基因推導(dǎo)氨基酸序列與5株疫苗株同源性在90.5%～95.6%，與H120疫苗株相比，差異主要在第209～248位和第333～366位，共36個(gè)氨基酸，無(wú)氨基酸的插入和缺失。

3 討論

雞傳染性支氣管炎是一種急性、高度接觸性傳染病，給我國(guó)以及世界養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大損失。因?yàn)樵摬《净蛐捅姸?，且存在較多變異，所以對(duì)該病毒的快速診斷和分析對(duì)IB防控來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。S基因的S1部分已被廣泛用于在分子水平上對(duì)IBV的血清型變異進(jìn)行分類(lèi)和研究[12]。本試驗(yàn)從廣東2個(gè)疑似感染IBV的發(fā)病雞群中分離得到了病毒，對(duì)2個(gè)分離株S1基因核苷酸序列的分析表明，CK/CH/GD/QY1119是LDT3型毒株，CK/CH/GD/HZ1225是QX型毒株。LDT3型IBV毒株在廣東已數(shù)年未見(jiàn)報(bào)道，CK/CH/GD/QY1119作為L(zhǎng)DT3型毒株，進(jìn)化樹(shù)分析卻顯示其M基因沒(méi)有和LDT3代表毒株劃分在一個(gè)分支內(nèi)，推測(cè)其已發(fā)生重組變異，具有特殊性。疫苗株與主要流行毒株血清型一致才能提供良好的保護(hù)作用[13]。推導(dǎo)氨基酸序列分析顯示，2個(gè)分離株的S1、M和N基因與2個(gè)雞群所用Mass型H120毒株相比均有一定突變，尤其是S1基因，其使用的疫苗并不能對(duì)2個(gè)分離株起到有效的免疫保護(hù)作用。

只有研制并推廣與當(dāng)?shù)亓餍卸局暄逍拖嗤囊呙绮拍軐?duì)IBV的流行進(jìn)行真正有效的防控。雞場(chǎng)也應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)雞群飼養(yǎng)管理,在季節(jié)交替時(shí)做到“大環(huán)境通風(fēng),小環(huán)境保溫”[14]。同時(shí)也應(yīng)當(dāng)在飼料中加入適量微量元素、礦物質(zhì)等添加劑，減少應(yīng)激，增強(qiáng)免疫力，進(jìn)行科學(xué)的消毒和免疫，合理調(diào)整雞群飼養(yǎng)密度，做好雞群保健和清潔衛(wèi)生工作。