2株毒力不同M.bovis 差異表達(dá)蛋白的定量檢測(cè)及分析

李夢(mèng)瑩，田 帥，董玉惠，馬小靜，張淮瑜，宋阿北，周向梅，許立華

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021 ； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

蛋白組學(xué)技術(shù)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記(Tandem mass tag，TMT)與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)相結(jié)合是一種基于標(biāo)記定量的新技術(shù)，可以對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)和多肽的定量分析[1]。TMT是定量蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的同位素標(biāo)記方法，它對(duì)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量提供了準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。該方法可對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行相互驗(yàn)證，為牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)的毒力蛋白以及致病性提供依據(jù)。

M.bovisC68004菌株是20世紀(jì)50年代從1頭患有結(jié)核病的牛組織中分離得到，M.bovisN菌株是2015年從具有典型全身性結(jié)核病癥狀的犢牛大腦中分離出來(lái)。程廣宇等對(duì)這2株細(xì)菌在小鼠模型上的致病性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)M.bovisN感染的小鼠肺部和脾臟的病變程度比M.bovisC68004感染的小鼠更為嚴(yán)重[2]。然而，仍然不清楚這2個(gè)菌株的毒力因子差異，以及它們?cè)诩ぐl(fā)宿主免疫反應(yīng)的不同是否與其蛋白表達(dá)差異有關(guān)。因此，本試驗(yàn)將2株牛分枝桿菌進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，找出差異表達(dá)蛋白，并分析這些差異蛋白對(duì)其致病性及毒力的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株M.bovis(菌株號(hào):C68004菌和N菌)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與制備 2株菌株均在添加10% OADC(油酸、牛血清蛋白V、右旋糖、過(guò)氧化氫酶)和1% Tween80的Middlebrook 7H9(BD Biosciences公司)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)菌OD值為0.6～0.8，3 000～5 000 g離心5～15 min，去上清，PBS洗滌沉淀3次，液氮速凍，菌體-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白樣品制備方法(勻漿裂解法[3]) 取菌體沉淀加入適量SDT裂解液，轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有適量石英砂(組織樣品另外加入1顆1/4英寸陶瓷珠)的2 mL離心管中，用美國(guó)MP勻漿儀進(jìn)行勻漿破碎(24 s×2，6.0 m/s，60 s，2次)。然后超聲(80 W，工作10 s，間歇15 s，循環(huán)10次)，沸水浴15 min。14 000 g 離心40 min，取上清采用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液。采用BCA(Bicinchoninic acid，BCA)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。分裝樣品，-80 ℃保存。

1.2.3 TMT標(biāo)記與分級(jí) 各樣品分別取100 μg肽段，按照Thermo公司TMT標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)記。將每組標(biāo)記后的肽段等量混合，采用High pH RP spin column進(jìn)行分級(jí)(使用指南：Pierce High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit)。肽段標(biāo)記混合凍干后取100 μg，使用300 μL 0.1%三氯乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)稀釋，轉(zhuǎn)移到High pH RP spin column后離心收集FT組分，加入300 μL純水，離心收集wash組分，然后開始梯度洗脫。樣品凍干后用12 μL 0.1% FA復(fù)溶，OD280測(cè)定肽段濃度[4]。

1.2.4 質(zhì)譜分析 每份樣品采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離，樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析[5]。分析時(shí)長(zhǎng)為60/90 min(根據(jù)具體試驗(yàn)方案而定)，檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍300～1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率在200 m/z為70 000，AGC target為3e6，一級(jí)Maximum IT為10 ms，Dynamic exclusion為40.0 s[5]。

1.2.5 平行反應(yīng)驗(yàn)證(Parallel reaction monitoring validation，PRM) 根據(jù)TMT標(biāo)簽制備肽，每個(gè)樣品中加入穩(wěn)定同位素肽段作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)參考[6]。在反相層析之前，將胰蛋白酶肽吸附到C18去鹽柱上[6]。使用5%～35%乙睛作為液相色譜梯度。在Q Exactive Plus質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)上進(jìn)行PRM分析，利用每個(gè)目標(biāo)蛋白的高強(qiáng)度和可靠度獨(dú)特肽，形成最顯著電荷狀態(tài)和保留時(shí)間的目標(biāo)肽[6]。質(zhì)譜儀正離子工作模式參數(shù)如下：全MS掃描分辨率為70 000(200 m/z)，自動(dòng)增控(Automatic gain control，AGC)目標(biāo)值為3.0×10-6，最大離子注入時(shí)間為250 ms。完成MS掃描后，進(jìn)行20次PRM掃描，掃描分辨率為35 000(200 m/z)。每個(gè)顯著目標(biāo)蛋白的單個(gè)肽段序列信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于每個(gè)樣本進(jìn)行量化和統(tǒng)一作為標(biāo)準(zhǔn)參考[6]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，用軟件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。

Gene Ontology (GO)功能注釋：DEPs序列在UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，同時(shí)使用SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI BLAST軟件查找相關(guān)功能[7-8]。利用BLAST2GO對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行GO注釋的過(guò)程大致可以歸納為序列比對(duì)(BLAST)、GO條目提取、GO注釋和補(bǔ)充注釋等4個(gè)步驟[9]。

KEGG通路分析：DEPs FASTA序列利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并提取相應(yīng)KEGG通路[10]。對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG通路注釋時(shí)，利用KAAS (KEGG automatic annotation server)軟件，首先通過(guò)比對(duì)KEGG GENES數(shù)據(jù)庫(kù)，將目標(biāo)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行KO歸類，并根據(jù)KO歸類自動(dòng)獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)序列參與的通路信息[10]。

蛋白質(zhì)聚類分析(Clustering)[7]：進(jìn)行聚類分析時(shí)，首先對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的定量信息進(jìn)行歸一化處理。其次，使用Cluster 3.0軟件對(duì)獲得的表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并使用Java Tree view軟件生成層次聚類熱圖。同時(shí)，采用歐幾里得算法計(jì)算并繪制熱圖。進(jìn)行聚類分析時(shí)，首先對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的定量信息進(jìn)行歸一化處理。其次，使用Cluster 3.0軟件同時(shí)對(duì)樣品和蛋白質(zhì)的表達(dá)量2個(gè)維度進(jìn)行分類。最后，使用Java Trewview軟件生成層次聚類熱圖。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)路分析(PPI)：首先從目標(biāo)蛋白質(zhì)序列來(lái)源的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)的Gene Symbol，利用這些Gene Symbol在IntAct (http://www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml)或者STRING (http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找有試驗(yàn)證據(jù)的目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的直接和間接相互作用關(guān)系，并使用CytoScape 軟件(版本號(hào)：3.2.1)生成相互作用網(wǎng)絡(luò)并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析[7]。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白總數(shù)M.bovisN和M.bovisC68004菌體蛋白經(jīng)胰酶消化后得到多肽。然后用高分辨率LC-MS/MS富集和分析肽，檢測(cè)各鑒定肽的質(zhì)量誤差，結(jié)果證實(shí)MS數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性(中插彩版圖1A)。得到的肽段長(zhǎng)度分布在3～29，符合胰蛋白酶肽的性質(zhì)(中插彩版圖1B)，并對(duì)不同肽序列的數(shù)量也進(jìn)行了評(píng)估(中插彩版圖1C)。蛋白質(zhì)定量結(jié)果以火山圖的形式顯示(中插彩版圖1D)，利用t檢驗(yàn)(Student’s Test)得到的褶皺變化和P繪制火山圖，顯示2組樣品之間的顯著差異。

圖1 M.bovis N和M.bovis C68004蛋白質(zhì)定量檢測(cè)Fig. 1 Proteome-wide identification of M.bovis N and M.bovis C68004A：質(zhì)譜誤差分布； B：肽段長(zhǎng)度分布； C：肽段數(shù)量評(píng)估； D：蛋白定量火山圖A:Mass error distribution; B:Peptide length distribution; C:Peptide count distribution; D:Volcano plot of protein quantification

本試驗(yàn)采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，共鑒定了2株M.bovis中2 174個(gè)共有蛋白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)篩選差異顯著蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs)表達(dá)變化的倍數(shù)超過(guò)1.2倍或小于0.83倍，同時(shí)P<0.05 (表1)。M.bovisN和M.bovisC68004 DEPs數(shù)量如表2所示，250個(gè)DEPs表達(dá)上調(diào)，229個(gè)DEPs表達(dá)下調(diào)。

表2 M.bovis N和M.bovis C68004顯著差異蛋白數(shù)量Table 2 Overall of DEPs numbers of M. bovis N and C68004

2.2 分層聚類分析(Hierarchical cluster analysis) 根據(jù)顯著性差異進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果表明，所選擇的蛋白(組間差異顯著)具有良好的特異性，能準(zhǔn)確篩選并較好地反映N和C68004之間的蛋白質(zhì)組整體變化。

2.3 Gene Ontology(GO)分析 GO分析2株菌之間的DEPs，如中插彩版圖2所示，圖中橫軸為生物過(guò)程(Biological process,BP)和分子功能(Molecular function,MF)，縱軸為DEPs蛋白數(shù)量。與基因表達(dá)調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄、RNA生物合成等生物過(guò)程相關(guān)的DEPs均為20個(gè)左右(RichFactor相似)，如基因表達(dá)調(diào)控，22個(gè)顯著DEPs，RichFactor=0.42(N/C68004)。分子功能中富集最多的是DNA結(jié)合，45個(gè)顯著DEPs，RichFactor=0.3(N/C68004)。

圖2 M.bovis N和C68004 GO富集前20個(gè)差異顯著蛋白Fig.2 Top 20 enriched GO terms of significantly DEPs between the M.bovis N and C68004 groups

2.4 KEGG通路分析(KEGG pathway analysis) KEGG通路分析結(jié)果如中插彩版圖3A所示，RNA聚合酶通路發(fā)生了顯著變化。調(diào)節(jié)這3種RNA聚合酶的基因分別是rpoA、rpoB和rpoC。M.bovisN有3種RNA聚合酶蛋白顯著上調(diào)，分別為DNA介導(dǎo)的RNA聚合酶亞基alpha、beta和beta′(見中插彩版圖3B)，這3個(gè)亞基在GO分子功能方面，屬于DNA結(jié)合蛋白(見中插彩版圖2)。

圖3 M.bovis N和M.bovis C68004 KEGG信號(hào)通路分析Fig. 3 KEGG pathway analysis of M. bovis N and M.bovis C68004A:RNA聚合酶通路； B：RNA聚合酶蛋白結(jié)構(gòu)A：RNA polymerase pathway; B:RNA polymerase protein structure

2.5 蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[Protein-protein interaction (PPI)network] 蛋白質(zhì)在體內(nèi)不是獨(dú)立存在的，它們的功能與其他蛋白質(zhì)相關(guān)或受其他蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，M.bovisN和M.bovisC68004之間的DEPs顯示出高度連結(jié)性，以黃色結(jié)點(diǎn)表示。30S核糖體蛋白S15(UniProtKB-P66430)、50S核糖體蛋白L2(UniProtKB-A1KGI5)、30S核糖體蛋白S10(UniProtKB-P0A5X1)互作結(jié)點(diǎn)最高，有29個(gè)DEPs交互連接。30S核糖體蛋白S15是rRNA的主要結(jié)合蛋白之一，它直接與16S rRNA結(jié)合[11]。50S核糖體蛋白L2是30S和50S亞基結(jié)合形成70S核糖體，而30S核糖體蛋白S10參與tRNA與核糖體的結(jié)合。

2.6 平行反應(yīng)驗(yàn)證[Parallel reaction monitoring(PRM)validation] 利用PRM驗(yàn)證基于TMT技術(shù)分析所得的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，采用LC-PRM/MS方法對(duì)M.bovisN和M.bovisC68004中的4個(gè)靶蛋白進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，4個(gè)DEPs分別是：A0A1R3XXR4(由lpqY基因編碼)、A0A1R3Y5 J6(由ecce1基因編碼)、A1KPE3(由rpoA基因編碼)、A0A109S6H6(由ropB基因編碼)。PRM結(jié)果顯示，這4個(gè)候選蛋白與TMT數(shù)據(jù)有相似的趨勢(shì)，目標(biāo)蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，這進(jìn)一步支持了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可信度和可靠性(圖4)。

圖4 所選DEPs相對(duì)定量與蛋白組數(shù)據(jù)匹配Fig. 4 Relative quantification of selected DEPs matched the proteomic data

3 討論

通過(guò)TMT對(duì)2株菌株的蛋白鑒定，篩選出了一些具有顯著差異和重要功能的蛋白，發(fā)現(xiàn)調(diào)控相應(yīng)蛋白的基因，并使用PRM方法進(jìn)一步驗(yàn)證了TMT分析數(shù)據(jù)。GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些DEPs的功能包括催化、結(jié)合、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及分子結(jié)構(gòu)相關(guān)作用，主要參與代謝和生物過(guò)程的調(diào)節(jié)，特別是對(duì)內(nèi)部或外部刺激的反應(yīng)。

研究表明，結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)進(jìn)化出許多逃避宿主免疫系統(tǒng)的途徑，包括選擇性抑制巨噬細(xì)胞IL-12p40的產(chǎn)生[12]。這一研究引起了對(duì)mmaA4基因的關(guān)注，該基因編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，是分枝菌酸遠(yuǎn)端進(jìn)行含氧修飾所必需的，也是參與抑制IL-12p40的關(guān)鍵位點(diǎn)[12]。突變體滅活mmaA4刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多IL-12p40和TNF-α，相比野生型結(jié)核分枝桿菌毒性減弱[12]。在本試驗(yàn)中，與M.bovisC68004相比，mmaA4基因在M.bovisN中的表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)mmaA4可能是導(dǎo)致N株毒力增強(qiáng)的重要毒力因子之一(比值N/C68004=3.137 502，來(lái)自TMT結(jié)果)。同時(shí)，這個(gè)毒力因子的推測(cè)與之前N感染小鼠模型病變程度比C68004感染更為嚴(yán)重的研究結(jié)果相一致[2]。這為進(jìn)一步研究M.bovisN的致病機(jī)制以及疫苗設(shè)計(jì)等方面提供了重要參考。

另一個(gè)重要的蛋白ecce1，屬于ESX-1型分泌系統(tǒng)蛋白。結(jié)核分枝桿菌的致病性與ESX-1分泌系統(tǒng)密切相關(guān)，該系統(tǒng)在改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、通過(guò)調(diào)節(jié)吞噬作用促進(jìn)細(xì)菌逃逸、抑制吞噬溶酶體融合、影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞裂解等方面發(fā)揮重要作用[13]。有研究報(bào)道，ecce1是結(jié)核分枝桿菌分泌ESX-1的核心膜蛋白[14]。因此，缺乏ESX-1系統(tǒng)分泌蛋白使結(jié)核分枝桿菌的毒性明顯降低。蛋白質(zhì)學(xué)結(jié)果與PRM驗(yàn)證結(jié)果一致表明，ecce1在N菌中蛋白表達(dá)量顯著高于C68004，這一結(jié)果說(shuō)明ecce1可能是N菌毒力增強(qiáng)與免疫逃避的一個(gè)重要因素。但對(duì)于M.bovis這個(gè)基因的研究甚少，其對(duì)發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與巨噬細(xì)胞的相互作用等方面的作用尚不清楚。

抗結(jié)核病一線藥物(如利福平)的關(guān)鍵耐藥基因包括rpoA、rpoB和rpoC。這3個(gè)耐藥基因在M.bovisN株中的表達(dá)均顯著高于C68004，這意味著臨床菌株N可能比C68004具有更強(qiáng)的耐藥性。就目前情況而言，由于結(jié)核分枝桿菌耐多藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致新疫苗開發(fā)進(jìn)展緩慢、診斷方法有限、治療時(shí)間延長(zhǎng)，這使結(jié)核病的預(yù)防與治療情況更加惡化[15]。N菌與C68004菌相比，與耐藥性相關(guān)的蛋白表達(dá)明顯升高，可能與動(dòng)物用藥增多有關(guān)。

也從側(cè)面反映了與20世紀(jì)50年代相比，抗生素廣泛用于人和動(dòng)物，對(duì)細(xì)菌耐藥性基因表達(dá)的影響，細(xì)菌在適應(yīng)環(huán)境改變中的巨大變化和對(duì)人類健康影響的巨大挑戰(zhàn)。

綜上，通過(guò)蛋白質(zhì)學(xué)的方法，初步分析出與毒力相關(guān)的致病因子和耐藥性相關(guān)的基因，如mmaA4、ecce1、rpoA、rpoB和rpoC，為進(jìn)一步的深入研究提供了可靠的理論基礎(chǔ)。