HLA-DQA1基因多態(tài)性與視神經(jīng)脊髓炎的相關(guān)性研究

周莉莉 朱師國 黃詩詩 朱蘭兵 王建勇 張雄 何志勇

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是主要累及視神經(jīng)及脊髓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎性脫髓鞘疾病[1]，其病因及發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。遺傳因素在NMO發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。近年來，歐洲開展了較大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)了位于人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因的一個(gè)易感區(qū)域HLA-DQA1，該區(qū)域中的rs28383224位點(diǎn)與NMO相關(guān)性較強(qiáng)[2]。HLA在機(jī)體免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)和炎癥參與NMO疾病過程，在NMO的發(fā)生和發(fā)展中有著重要作用[3-4]，HLA-DQA1區(qū)域可能是導(dǎo)致NMO的重要遺傳因素。盡管國內(nèi)外一些學(xué)者己經(jīng)對HLA基因多態(tài)性與NMO易感性的關(guān)聯(lián)作了相關(guān)研究，但由于等位基因及其頻率存在種族及地區(qū)差異性，各地研究結(jié)果不一，故目前尚無定論。本研究分析HLA-DQA1基因多態(tài)性與漢族人群NMO的相關(guān)性，探討NMO的發(fā)病機(jī)制，為早期診斷及治療提供幫助，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2015年1月至2020年5月就診于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院脫髓鞘專病門診的NMO確診患者（NMO患者組）51例，其中男8例，女43例，年齡 10～83（46.31±17.27）歲；擴(kuò)展殘疾狀況（expanded disability status scale，EDSS）評(píng)分為（2.66±2.12）分。NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)參考Wingerchuk等[5]2015年的提議：（1）血清水通道蛋白 4（acquaporin 4，AQP4）-IgG 陽性：至少有一個(gè)核心臨床特征；AQP4-IgG陽性（細(xì)胞轉(zhuǎn)染法）；排除其他診斷。（2）AQP4-IgG陰性或AQP4-IgG狀態(tài)未知：①在1次或多次臨床發(fā)作中，至少2項(xiàng)核心臨床特征并滿足下列全部條件：至少1項(xiàng)臨床核心特征為視神經(jīng)炎、急性脊髓炎或延髓極后區(qū)綜合征；空間多發(fā)（2個(gè)或以上不同的臨床核心特征）；滿足MRI附加條件；②檢測AQP4-IgG陰性或未檢測；③排除其他診斷。另選擇同期本院健康體檢者86例作為健康對照組，其中男16例，女 70 例，年齡 19～83（48.60±16.05）歲。兩組對象性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。NMO患者組中合并干燥綜合征4例，重癥肌無力、橋本甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)各1例。根據(jù)AQP4-IgG抗體檢測結(jié)果將NMO患者組再分為AQP4-IgG陽性亞組43例和AQP4-IgG陰性亞組8例。本次研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：LCKY2019-159），兩組對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NMO患者組臨床資料的收集 收集、分析AQP4-IgG陽性亞組和陰性亞組NMO患者的性別、年齡、發(fā)病年齡、EDSS評(píng)分、首發(fā)癥狀（包括視神經(jīng)炎、脊髓炎、視神經(jīng)炎合并脊髓炎、極后區(qū)癥狀）、合并免疫系統(tǒng)疾病、MRI表現(xiàn)（受累脊髓節(jié)段＞3、伴有顱內(nèi)病灶）。

1.2.2 MRI檢查方法 NMO患者組行MRI檢查，使用MR專用的頭顱線圈，用海綿墊固定患者頭部。所有NMO患者組均使用美國GE Signal 3.0T超導(dǎo)型MR成像儀及相控陣頭線圈。（1）頭顱MRI成像序列：軸位自選回波T1WI、T2WI、水抑制反轉(zhuǎn)回波成像及矢狀位自選回波T1WI。（2）視神經(jīng)MRI成像序列：軸位自選回波T1WI、T2WI、水抑制反轉(zhuǎn)回波成像及矢狀位自選回波T1WI。（3）脊髓MRI成像序列：矢狀位快速自選回波T1WI、T2WI、脂肪抑制成像及軸位自選回波T2WI。增強(qiáng)MRI檢查中，完成定位像掃描后，靜脈注射對比劑釓噴酸葡胺（0.1 mmol/kg）20 ml，注射對比劑完畢后再依次進(jìn)行矢狀位、冠狀位和軸位T1WI序列增強(qiáng)掃描。

1.2.3 基因型分析 （1）血液標(biāo)本采集：分別抽取NMO兩組受檢者外周靜脈血2 ml，用肝素抗凝，于-80℃冰箱保存。（2）血液標(biāo)本基因組DNA的提?。翰捎玫聡鳴iagen公司QIAmp血液基因組DNA提取試劑盒提取NMO患者組及健康對照組外周血DNA，用NanoDrop2000分光光度計(jì)測定DNA濃度及純度，控制OD260/OD280在 1.7～1.8。（3）基因型檢測：用 PCR 對 rs28383224位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。其正向引物序列為F：5'CACTGTGGGATGAGGAGATGA 3'；反向引物序列為 R：5'CCATTGGCTCCCTTGATCCT 3'。用DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,用3730XL基因測序儀對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，由北京擎科生物科技有限公司完成。采用Sequencing Analysis 5.2軟件對峰圖數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)比對結(jié)果判讀基因分型，并進(jìn)一步進(jìn)行比較分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件。通過直接計(jì)數(shù)法對rs28383224位點(diǎn)基因型和等位基因頻率進(jìn)行計(jì)算。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U及Wilcoxon W秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用logistic回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP4-IgG陽性、陰性亞組患者臨床資料比較 見表1。

由表1可見，AQP4-IgG陽性亞組和AQP4-IgG陰性亞組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。

表1 AQP4-IgG陽性、陰性亞組患者臨床資料比較

2.2 MRI檢查結(jié)果 NMO患者組中51例均完成了頭顱MRI、脊髓MRI。頭顱MRI檢查發(fā)現(xiàn)大腦異常信號(hào)改變9例，延髓異常信號(hào)改變3例。脊髓MRI掃描顯示有不同程度的脊髓受累35例。NMO患者組中30例患者完成了視神經(jīng)MRI檢查，其中發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)信號(hào)異常改變19例。視神經(jīng)、脊髓典型病變見圖1-3。

圖1 1例56歲女性患者的視神經(jīng)和頸髓MRI圖像[a：冠狀位T2WI壓脂序列，顯示左側(cè)視神經(jīng)高信號(hào)（箭頭所示）；b：軸位T2WI壓脂序列，顯示右側(cè)視神經(jīng)腫脹，雙側(cè)視神經(jīng)高信號(hào)（箭頭所示）；c：頸髓矢狀位脂肪抑制成像序列，顯示C5～7平面脊髓增粗伴縱行條片狀高信號(hào)影（箭頭所示）]

圖2 1例54歲女性患者的胸髓MRI圖像[a、b：T2WI序列，顯示C4～T10平面脊髓廣泛異常信號(hào)（箭頭所示）；c：增強(qiáng)MRI序列，顯示胸髓不均勻強(qiáng)化（箭頭所示）]

圖3 1例62歲女性患者的頭顱MRI圖像[a：頭顱T2水抑制反轉(zhuǎn)回波成像序列，顯示延髓極后區(qū)異常高信號(hào)（箭頭所示）；b、c：MRI增強(qiáng)序列，顯示延髓極后區(qū)及頸髓多發(fā)斑點(diǎn)狀、小片狀強(qiáng)化影（箭頭所示）]

2.3 NMO患者組和健康對照組rs28383224基因檢測結(jié)果比較 NMO患者組和健康對照組DNA片段測序圖見圖4（插頁）。兩組對象rs28383224基因型頻率和等位基因頻率分布見表2。

圖4 視神經(jīng)脊髓炎（NMO）患者組和健康對照組DNA片段測序圖（箭頭所示為rs28383224多態(tài)性位點(diǎn)的基因型）

由圖4可見，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，得出NMO患者組與健康對照組rs28383224位點(diǎn)的多態(tài)性基因型觀測值與期望值檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg（P＞0.05），表明兩組研究對象具有較好的群體代表性。

由表2可見，兩組對象rs28383224基因型頻率和等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 NMO患者組和健康對照組rs28383224基因型頻率和等位基因頻率分布[例（%）]

通過logistic回歸分析，提示rs28383224多態(tài)性與NMO發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)性（AG比AA：OR=1.028，95%CI：0.371 ～2.848，P=0.957；GG 比 AA：OR=0.672，95%CI：0.283～1.599，P=0.369，均 P ＞0.05）。

3 討論

NMO是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，以視神經(jīng)或脊髓相繼或同時(shí)受累為主要表現(xiàn)，將引起不可逆的損傷，是中青年常見的致盲致殘性疾病。2004年，NMO特異抗體AQP4-IgG確定為NMO的特異抗體[6]。隨著對AQP4-IgG認(rèn)識(shí)的深入和應(yīng)用推廣，2015年新的NMO譜系病國際診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，提出根據(jù)血清AQP4-IgG檢測結(jié)果進(jìn)行分層，包括AQP4-IgG陽性、AQP4-IgG陰性以及無法檢測AQP4-IgG的NMO譜系病[7]。NMO的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為其可能機(jī)制涉及免疫、遺傳、環(huán)境等諸多因素，其中尤其是對遺傳學(xué)因素研究甚少[8]。本研究比較了不同抗體類型NMO患者的臨床特征，發(fā)現(xiàn)不同亞型患者臨床癥狀有著明顯差異，并對NMO的相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)一步深入研究。

目前NMO免疫學(xué)相關(guān)的病因錯(cuò)綜復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。人類主要組織相容性復(fù)合體通常被稱為HLA，定位于人類第6號(hào)染色體短臂，呈高度多態(tài)性，有高度遺傳多態(tài)性，各等位基因頻率分布因不同種族、群體、地域而異，與許多自身免疫性疾病的遺傳易感性密切相關(guān)，其基因多態(tài)性決定了HLA系統(tǒng)參與的免疫反應(yīng)的多樣性和復(fù)雜性。既往國內(nèi)外關(guān)于NMO的遺傳因素研究多集中于HLA基因。研究結(jié)果顯示，90%以上的NMO患者與HLA等位基因DPB1*0501和DPB1*0301密切相關(guān)，其中亞洲人或黑種人NMO發(fā)病主要與DPB1*0501相關(guān)，而在白種人群中最常見的則是 DPB1*0301[9]。Wang 等[10]分析了 HLA-DRB1 和 HLADPB1等位基因在中國南方漢族人NMO發(fā)病中的作用，發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*0501與南方漢族人群AQP4-Ab陽性NMO發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。NMO易感性與不同HLA基因多態(tài)性相關(guān)可能由種族、地域不同所致，進(jìn)一步支持了NMO的發(fā)病與遺傳因素有關(guān)。

HLA-DQA1位于6p21.32，是一組免疫應(yīng)答基因，Estrada等[2]對歐洲人的研究中發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1和C4A/C4B位點(diǎn)與NMO存在密切相關(guān)性。同時(shí)后續(xù)有關(guān)HLADQA1與NMO的相關(guān)性研究如Ogawa等[11]，在日本人群中檢測到HLA-DQA1*05:03位點(diǎn)與NMO的發(fā)病存在正相關(guān)，而HLA-DQA1*01:01、HLA-DQA1*03:02未發(fā)現(xiàn)與NMO的發(fā)病相關(guān)，表明HLA-DQA1基因的單核苷酸多態(tài)在不同人群中與NMO的相關(guān)性有一定的差異，其是否為NMO的危險(xiǎn)因素還需進(jìn)一步擴(kuò)大其他國家或地區(qū)的調(diào)查研究。目前關(guān)于中國NMO患者與HLA-DQA1基因多態(tài)性研究報(bào)道尚較少見。本研究選取了HLA-DQA1區(qū)域中與NMO相關(guān)性最強(qiáng)的rs28383224在漢族人中進(jìn)行了驗(yàn)證，采用具有靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的基因測序法對51例NMO患者和86例健康對照者作了HLA-DQA1區(qū)域rs28383224的基因型分析，本研究結(jié)果暫不支持rs28383224多態(tài)性是漢族人群NMO的危險(xiǎn)因素，但不能就此排除HLA-DQA1基因參與NMO發(fā)病的可能性。本研究結(jié)果一方面可能是由地區(qū)或者種族差異引起，另一方面可能我們的研究樣本量相對較小。

由于NMO的易感性與多基因相關(guān)，除AQP-4等已知易感基因外，HLA-DPB、CD40、IL-17和 TNFSF4等候選基因也可能影響患者NMO易感性[12-15]。因此，需要后期進(jìn)行多中心、大樣本、大規(guī)模研究來證實(shí)，同時(shí)進(jìn)一步探索NMO新的易感基因及保護(hù)基因。隨著對NMO遺傳機(jī)制認(rèn)識(shí)及研究的不斷深入，從基因遺傳學(xué)方面加深對AQP4-IgG陽性及陰性NMO的再認(rèn)識(shí)，針對性地為臨床治療提供新線索。