碳點-二氧化錳納米復合材料的制備及硫普羅寧的熒光傳感

王 琦 司亞鑫 楊 田 高熒羲 高曉鋒 朱 彬 馬春蕾

(太原工業(yè)學院化學與化工系，太原 030008)

0 引言

硫普羅寧(tiopronin，TPN)是一種人工合成的氨基硫醇，它是臨床上治療胱氨酸尿癥、類風濕關節(jié)炎、肝紊亂等疾病的重要藥物[1-3]。此外，由于TPN分子中存在活性巰基，其具有消除自由基、抵抗氧化壓力的作用[4-5]，而巰基與重金屬離子的結合作用，也使得其成為一種臨床上常用的解毒劑[6-7]。TPN的分子結構如圖1所示。

圖1 TPN的分子結構Fig.1 Molecular structure of TPN

然而，過量地服用或不當?shù)厥褂肨PN也可能會引起諸如腸胃不適、味覺失靈、肌無力、尿蛋白等副作用[8-10]。因此，建立便捷、靈敏的分析方法來測定生物體液中的TPN含量具有重要意義。截至目前，研究者們設計開發(fā)了眾多測定TPN的方法，包括高效液相色譜法[11-12]、電化學測定法[13]、化學發(fā)光法[14]、分光光度法[15]、磷光光譜法[16]、熒光光譜法[17-18]等。其中，熒光分析法由于快速、靈敏的優(yōu)點備受青睞。

二氧化錳納米材料(Nano-MnO2)具有低成本、高比表面積、摩爾消光系數(shù)大、生物相容性好等優(yōu)點[19-21]。此外，Nano-MnO2還具有優(yōu)開的光吸收性能和快速電子轉移能力，這就賦予了它們作為熒光猝滅劑高效猝滅熒光的能力[22]?；诖?，多種MnO2納米材料被開發(fā)并與熒光材料構建復合熒光體系，通過熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)、靜態(tài)猝滅效應(static quenching effect，SQE)和內濾效應(inner filter effect，IFE)等途徑實現(xiàn)了熒光猝滅[23-25]。另一方面，活性巰基能夠與MnO2發(fā)生特開性的氧化還原反應，使得后者降解為錳離子[26-28]，失去了MnO2的性能，這就為基于MnO2的熒光復合體系提供了新穎的傳感模式。

基于上述研究，我們以聚烯丙胺鹽酸鹽(PAH)為反應底物，通過一步水熱法制備了熒光碳點(carbon dots，CDs)，基于高錳酸鉀處理納米材料的技術[29]，在CDs溶液中加入高錳酸鉀，通過原位氧化還原反應制備得到了CDs-MnO2納米復合材料。MnO2通過SQE和IFE有效地猝滅了CDs的熒光，而在復合體系中引入TPN后，由于后者分子中活性巰基與MnO2的特開反應，MnO2被降解進而使熒光恢復。由此建立了基于CDs-MnO2的熒光傳感模式測定TPN的新方法。該MnO2調控的熒光開關傳感原理被首次用于TPN的測定，這對TPN的分析檢測是一個有效的補充。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

PAH(95%)、TPN(98%)購自阿拉丁試劑有限公司；高錳酸鉀及其他試劑均為國產分析純；實驗中用水均為二次去離子水；尿液樣品來自健康的志愿者，測定前過濾并稀釋50倍。

所用儀器有：透射電子顯微鏡(Talos F200X，美國Thermo Scientific公司，加速電壓200 kV、功率5 kW)；X射線光電子能譜儀(XSAM 800，英國Kratos公司，激發(fā)光源 AlKα)；納米粒度儀(ZS90，英國 Malvern公司)；熒光光譜儀(F-7000，日本Hitachi公司，激發(fā)波長380 nm，狹縫寬度5 nm)；紫外-可見光譜儀(TU-1901，中國普析公司)；瞬態(tài)熒光光譜儀(FLS 1000，英國Edinburgh公司)。

1.2 CDs和CDs-MnO2納米復合材料的制備

以PAH為反應底物，通過一步水熱法制備熒光CDs。首先，取1 g PAH粉末溶于100 mL水中，完全溶解后轉移到聚四氟乙烯反應釜中，在180℃下反應2 h。然后，將得到的淡黃色溶液冷卻后轉移至節(jié)流分子量為3 500 kDa的透析袋中，在去離子水中透析24 h進一步純化產物溶液。最后，將得到的CDs溶液保存在冰箱中備用。

CDs-MnO2納米復合材料通過原位的氧化還原反應制備而得。首先，取上述CDs溶液10 mL，在攪拌的條件下逐滴加入0.5 mL濃度為10 mmol·L-1的高錳酸鉀溶液，持續(xù)攪拌反應10 min。然后將得到的棕色溶液轉移入節(jié)流分子量3 500 kDa的透析袋中，在去離子水中透析24 h純化。最后將得到的產品溶液保存在冰箱中備用。

1.3 熒光檢測TPN

基于CDs-MnO2納米復合材料的熒光檢測TPN在pH=5的HAc-NaAc緩沖液中測定。將上述100 μL CDs-MnO2溶液加入到 800 μL pH=5 的緩沖液中，混勻后立即加入100 μL不同濃度的TPN溶液或去離子水(作為空白對照)中，混勻后測定其在380 nm激發(fā)下440 nm處的熒光強度。熒光光譜儀的狹縫寬度設置為5 nm。所有的測試全部平行測定3次。

1.4 尿液樣品的檢測

取100 μL制備好的CDs-MnO2溶液加入到700 μL pH=5的緩沖液中，再加入100 μL尿液樣品和100 μL已知濃度的TPN溶液(5、15、60 μmol·L-1)中，保持最終體積為1 mL?；靹蚝鬁y定所得樣品溶液在380 nm激發(fā)下440 nm處的熒光強度，并計算其加標回收率。

2 結果與討論

2.1 CDs和CDs-MnO2納米復合材料的表征

通過TEM表征制備所得的CDs和CDs-MnO2納米復合材料的形貌。如圖2A所示，均勻分散的CDs小顆粒表明了其尺寸在5 nm以下且呈現(xiàn)球形。而圖2B中CDs-MnO2的尺寸則明顯變大且有一定程度的團聚。插圖分別是CDs溶液和CDs-MnO2溶液的照片，可以看出淡黃色的CDs在復合MnO2納米材料后溶液變?yōu)樽厣榱搜芯窟@2種納米材料的尺寸分布，分別測試了兩者的納米粒度分布(圖2C和2D)。結果表明，CDs的尺寸處于3.12～7.53 nm的范圍之內，其平均粒度為4.33 nm；而CDs-MnO2的尺寸處于21.04～50.75 nm的范圍之內，其平均粒度為29.74 nm。上述結果表明，以PAH為反應底物，通過水熱法成功制備了CDs，且基于高錳酸鉀的氧化還原反應，成功得到了CDs-MnO2納米復合材料。

圖2 (A)CDs和(B)CDs-MnO2納米復合材料的TEM圖,插圖為相應溶液的照片;(C)CDs和(D)CDs-MnO2納米復合材料的納米粒度分布圖Fig.2 (A)TEM images of CDs and CDs-MnO2 nanocomposite,insets are corresponding photos;Nanoparticle particle size distribution curves of(C)CDs and(D)CDs-MnO2 nanocomposite

進一步通過XPS研究了CDs和CDs-MnO2納米復合材料的元素組成。CDs的XPS全譜圖中可觀察到 C1s、N1s、O1s的特征峰(圖 3A)，證明 CDs是由 C、N、O元素組成。而在CDs的基礎上，CDs-MnO2的XPS全譜圖(圖3B)中明顯地出現(xiàn)了Mn2p的特征峰，證明了MnO2的復合。圖3C～3F依次為CDs-MnO2中Mn2p、O1s、C1s、N1s的高分辨XPS譜圖。Mn2p擬合譜圖中(圖3C)位于653.8和642.3 eV處的2個峰對應Mn2p1/2和 Mn2p3/2的特征峰[23]。在 O1s的擬合譜圖(圖3D)中，可以觀察到532.2、531.0和529.7 eV三個分峰，分別對應C—O—H/C—O—C、Mn—O—H、Mn—O—Mn的結合形式[28]。C1s的擬合譜圖(圖3E)表明，C有3種不同的結合形式，即O＝C—OH(288.2 eV)、C—N(285.6 eV)、C—C(284.7 eV)[23]。N1s的擬合譜圖(圖3F)在401.2和399.1 eV處出現(xiàn)了分峰，分別源自于N—(C)3和C—N—C[23]。

圖3 (A)CDs和(B)CDs-MnO2的XPS全譜圖;CDs-MnO2的(C)Mn2p、(D)O1s、(E)C1s和(F)N1s高分辨XPS譜圖Fig.3 XPS full scan spectra of(A)CDs and(B)CDs-MnO2;(C)Mn2p,(D)O1s,(E)C1s and(F)N1s high resolution XPS spectra of CDs-MnO2

2.2 TPN對CDs-MnO2熒光性能的影響

圖4A為CDs-MnO2納米復合材料的制備及熒光傳感TPN的示意圖。如圖所示，由PAH制備而得的CDs與高錳酸鉀反應后生成了CDs-MnO2納米復合材料，且MnO2有效地猝滅了CDs熒光；TPN加入后與MnO2發(fā)生氧化還原反應使其降解，猝滅劑消失從而熒光得以恢復?；谶@種傳感原理，建立了以MnO2納米材料調控熒光的方法來測定TPN。圖4B所示為CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在380 nm激發(fā)下的熒光光譜。從圖中可知，CDs表現(xiàn)出了優(yōu)開的熒光性能，而CDs的熒光在復合MnO2后明顯地減弱，進一步加入TPN降解MnO2后熒光又表現(xiàn)出一定程度的恢復。從圖4C中三者在365 nm紫外燈照射下的照片能夠直觀地觀察到溶液體系藍色熒光的降低和恢復。

圖4 (A)CDs-MnO2納米復合材料的制備及熒光傳感TPN的示意圖;(B)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液的熒光光譜圖;(C)CDs(1)、CDs-MnO2(2)、CDs-MnO2+TPN(3)溶液在365 nm的紫外燈照射下的照片F(xiàn)ig.4 (A)Scheme of synthesis of CDs-MnO2 and fluorescent sensing of TPN;(B)Fluorescence spectra of CDs,CDs-MnO2 nanocomposite and CDs-MnO2+TPN;(C)Photographs of CDs(1),CDs-MnO2(2)and CDs-MnO2+TPN(3)solutions under UV(365 nm,center)illumination

2.3 熒光傳感機理研究

為了研究MnO2猝滅CDs熒光和TPN恢復熒光的機理，我們測試了 CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在440 nm處的時間分辨熒光衰減光譜(圖5A)。通過多指數(shù)熒光衰減擬合數(shù)據(jù)可知(表1)，CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN的熒光壽命分別是4.33、4.66、4.81 ns。該結果表明，在復合MnO2前后及CDs-MnO2與TPN反應前后，CDs的熒光壽命并沒有發(fā)生明顯的變化，這說明MnO2對CDs的熒光猝滅機理屬于靜態(tài)猝滅[30]。此外，圖5B對比了CDs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖以及CDs-MnO2納米復合材料的紫外-可見吸收光譜圖。結果表明，MnO2在240～600 nm出現(xiàn)了寬的吸收峰，這與CDs的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜有較大程度的重疊，這就說明IFE也對CDs的熒光猝滅起一定作用[31]。因此，MnO2對CDs的熒光猝滅是由SQE和IFE共同引起的。

表1 多指數(shù)熒光衰減擬合參數(shù)aTable 1 Fitting parametersa of multi-exponential to the fluorescence decay

另一方面，我們研究了TPN刺激的熒光恢復機理，如圖5C所示，復合MnO2之后，復合材料在240～600 nm范圍內出現(xiàn)了新的吸收帶。加入TPN之后，由于其與MnO2的氧化還原反應，使得MnO2降解、消失，光譜圖上也表現(xiàn)出寬吸收帶的消失。從圖5D中的照片能直觀地看出，復合MnO2之后，溶液顏色變?yōu)樽厣?，加入TPN后棕色消失，也證明了MnO2被還原降解。因此，該熒光體系的熒光恢復機理是TPN刺激下的氧化還原反應造成了猝滅劑降解、消失。

圖5 (A)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2-TPN的時間分辨熒光衰減光譜圖;(B)CDs的熒光激發(fā)、熒光發(fā)射和CDs-MnO2的紫外-可見吸收的光譜重疊對照圖;(C)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN的紫外-可見吸收光譜圖;(D)CDs(1)、CDs-MnO2(2)和 CDs-MnO2+TPN(3)溶液的照片F(xiàn)ig.5 (A)Time-resolved fluorescence decay spectra of CDs,CDs-MnO2 and CDs-MnO2+TPN;(B)Spectral overlap of fluorescence excitation and emission spectra of CDs and UV-Vis absorption of CDs-MnO2;(C)UV-Vis absorption spectra of CDs,CDs-MnO2and CDs-MnO2+TPN;(D)Photos of CDs(1),CDs-MnO2(2)and CDs-MnO2+TPN(3)solutions

2.4 熒光測定TPN的條件參數(shù)優(yōu)化

基于上述研究，TPN具有刺激MnO2分解引起熒光恢復的性能，因此CDs-MnO2納米復合材料能夠用于TPN的分析測定。由于MnO2的原位生成，熒光猝滅在生成MnO2的同時就已實現(xiàn)，響應時間由TPN與MnO2的反應時間決定。圖6A考察了加入TPN后，CDs-MnO2體系的熒光光譜變化。如圖所示，加入TPN后，熒光強度逐漸增強，最后趨于平穩(wěn)。圖6B為加入TPN后不同時間下的熒光恢復效率(F/F0，其中F0指的是CDs-MnO2的初始熒光強度，F(xiàn)指加入TPN后CDs-MnO2體系的熒光強度)。由圖可知，反應1 min后熒光恢復基本趨于穩(wěn)定。因此，CDs-MnO2可以快速檢測TPN。此外，體系的pH值會影響TPN與MnO2的氧化還原反應，是影響TPN測定的關鍵因素。如圖6C所示，我們分別測定了CDs-MnO2納米復合材料及CDs-MnO2+TPN在不同pH值的HAc-NaAc緩沖液中的熒光強度。圖6D為不同pH值條件下TPN對CDs-MnO2納米復合體系的熒光恢復效率。由圖6C、6D可知，當體系pH=5時，熒光恢復效率最佳。因此，為了后續(xù)靈敏度實驗，我們選擇該酸度作為測定TPN的最佳條件。

圖6 (A)在TPN加入后CDs-MnO2在不同時間下的熒光光譜圖;(B)不同時間下TPN對CDs-MnO2的熒光恢復效率;(C)CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在不同pH值下的熒光強度;(D)不同pH值下TPN對CDs-MnO2的熒光恢復效率Fig.6 (A)Fluorescence spectra of CDs-MnO2 at different times after addition of TPN;(B)Fluorescence recovery efficiency of CDs-MnO2 by TPN at different times;(C)Fluorescence intensity of CDs-MnO2 and CDs-MnO2+TPN solutions under different pH values;(D)Fluorescence recovery efficiency of CDs-MnO2 by TPN under different pH values

2.5 標準曲線和選擇性

在TPN的最佳響應條件(pH=5)下，測定了不同濃度的TPN對CDs-MnO2納米復合體系的熒光恢復效率(圖7A)。結果表明，體系的熒光恢復效率與TPN 的濃度在 0.2～80 μmol·L-1的范圍內呈線性關系，且符合線性方程F/F0=1.064 8+0.005 9c(R2=0.997 5)，其中c是 TPN的濃度(μmol·L-1)，檢出限為0.11 μmol·L-1(3σ/S，σ為標準偏差，S為檢測靈敏度)。此外，考察了CDs-MnO2納米復合熒光體系測定TPN的選擇性(圖7B)。如圖7B所示，TPN表現(xiàn)出明顯的熒光恢復，而其余可能共存的金屬離子和代謝產物在與TPN相同濃度時，并未對CDs-MnO2納米復合熒光體系產生恢復。該結果證明CDs-MnO2對TPN的測定具有良好的選擇性。需要指出的是，其他含巰基基團的生物分子如谷胱甘肽也能對CDs-MnO2納米復合熒光體系產生響應[28]，然而，有報道稱尿液樣品中并不含有此類生物分子[32]，且生物巰基分子的干擾能夠通過稀釋樣品而消除[16]。因此實際樣品檢測中能夠避免其他含巰基基團分子的干擾。

圖7 (A)CDs-MnO2測定TPN的標準曲線;(B)CDs-MnO2測定TPN的選擇性Fig.7 (A)Linear calibration plot for TPN determination based on CDs-MnO2;(B)Selectivity of CDs-MnO2 for TPN detection

2.6 實際樣品測定

由于CDs-MnO2具有良好的測定TPN的性能，該納米復合熒光體系可用于實際人體尿液樣品中TPN含量的測定，結果如表2所示。結果表明，該方法中樣品的加標回收率在97.57%～102.58%范圍之內，證明了CDs-MnO2納米復合熒光體系在實際樣品中測定TPN具有一定的可靠性。

表2 尿液樣品中TPN含量的測定Table 2 Determination of TPN in human urine sample

3 結 論

通過PAH水熱法制備得到了熒光CDs，并利用原位的氧化還原反應制備了CDs-MnO2納米復合材料。通過靜態(tài)猝滅效應和內濾效應，MnO2有效地猝滅了CDs熒光；進一步地，由于TPN的活性巰基與MnO2的氧化還原作用，使得MnO2降解、消失，進而實現(xiàn)熒光恢復?；诖?，建立了MnO2調控的熒光傳感體系來測定TPN。該納米材料的制備方法簡單便捷，熒光傳感高且具有靈敏、高選擇的優(yōu)點。該MnO2調控的熒光開關傳感原理被首次用于TPN的測定，這對TPN的分析檢測是一個有效的補充。