基于氣相色譜法測定食品中甜蜜素的堿性水解法研究

劉志鵬，楊李勝，王小鵬，黃敏興，林繼欽，余構彬，陳其釗*

（1.廣東省科學院生物工程研究所，廣東 廣州 510316；2.中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術研究中心，廣東 廣州 510316）

甜蜜素（sodium cyclamate），其化學名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉（C6H11NHSO3—Na），由氨基磺酸與環(huán)己胺及NaOH反應而制成的非營養(yǎng)型合成甜味劑，是食品生產中常用的添加劑，其口感好、價格低廉，甜度為蔗糖的30倍～40倍[1-2]。關于甜蜜素的安全性，學術界仍無定論。我國科學家在研究甜蜜素安全性方面有一定的成果，葉桂珍[3]采用體重為24g～29g的NIH小鼠進行對照實驗，結果發(fā)現(xiàn)，受試小鼠未出現(xiàn)癌變。黃俊明[4]采用NIH小鼠進行急性毒性實驗、蓄積毒性實驗和小鼠骨髓微核實驗后得出結論，甜蜜素屬于無毒化合物，且無致畸致突變性。但如果經(jīng)常食用甜蜜素含量超標的飲料或其它食品，就會因攝入過量，對人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害，特別是對代謝排毒能力較弱的老人、孕婦、小孩危害更明顯[5]。因此，我國食品安全國家標準GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規(guī)定了甜蜜素使用范圍[6]。由于食品的組成成分比較復雜，所以食品中甜蜜素有不同的前處理和檢測方法。目前國內外食品中甜蜜素檢測的方法主要有：氣相色譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-11]、離子色譜法[12-13]、氣相色譜串聯(lián)質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[14-15]、液相色譜串聯(lián)質譜法[16-18]、比色法[19]等方法。比色法檢出限高，不利于低濃度的檢測。氣相色譜質譜法和液相色譜質譜法由于儀器昂貴，儀器使用成本高，不利于方法的推廣。離子色譜法對基質潔凈度要求高，前處理過程繁瑣。目前甜蜜素含量檢測采用最多的是GB5009.97—2016《食品安全國家標準食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》中的第一法，即氣相色譜法[20]。但該方法在檢測時經(jīng)常會同時出現(xiàn)兩個峰，分別是主峰環(huán)己醇亞硝酸酯和次峰環(huán)己醇。日常的檢測發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長和溫度的上升，主峰環(huán)己醇亞硝酸酯逐漸減小，而次峰環(huán)己醇逐漸增大，對定量造成影響。推測其可能的原因是，酯類物質在酸性和高溫條件下發(fā)生可逆反應生成醇和酸。程水連等[21]曾研究過在前處理過程中加入氫氧化鈉，在堿性水解條件下促使環(huán)己醇亞硝酸酯向環(huán)己醇的方向轉變。本次研究主要在國標法的基礎上改進，采用進一步堿性水解，使環(huán)己醇亞硝酸酯完全轉化為環(huán)己醇，通過氣相色譜外標法測定樣品酯化后的水解產物環(huán)己醇的含量，從而間接準確測定甜蜜素的含量。再通過對水解液的pH值、反應溫度對整個反應體系影響的研究，進一步優(yōu)化方法，為檢測食品中的甜蜜素提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗所用的樣品：市售。

正庚烷（色譜純）：美國默克公司；環(huán)己基氨基磺酸鈉標準品（質量分數(shù)為99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；氯化鈉、亞硝酸鈉、濃硫酸、氫氧化鈉（分析純）：廣州化學試劑廠；試驗用水均為一級水。

氣相色譜儀（7890A）：美國安捷倫公司；電子天平（TLE204E）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；渦旋振蕩器（VB424）：德國Wiggens公司；臺式高速冷凍離心機（H1850R）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)己基氨基磺酸鈉標準使用液的制備

精確稱取0.561 2 g環(huán)己基氨基磺酸鈉標準品，加入水溶解并定容至100 mL，混勻，備用。此溶液1.00 mL相當于環(huán)己基氨基磺酸5.00 mg（環(huán)己基氨基磺酸鈉與環(huán)己基氨基磺酸的換算系數(shù)為0.890 9）。準確移取20 mL，用水稀釋定容100 mL（濃度為1.00 mg/mL）。

1.2.2 其它溶液配制

40 g/L氫氧化鈉溶液的制備：稱取4 g氫氧化鈉，加水溶解，后用水定容至100 mL，混勻，靜置備用。

200 g/L硫酸溶液的制備：量取54 mL濃硫酸，緩慢加入400 mL水中，后加水定容至500 mL，混勻，靜置備用。

50 g/L亞硝酸鈉溶液的制備：稱取5.00 g亞硝酸鈉，加水溶解，后用水定容至100 mL，混勻，靜置備用。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；柱流速：1.5 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1 μL；分流比：10 比 1；檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度：300 ℃；氫氣（H2）流速：30 mL/min；空氣流速：400 mL/min；程序升溫：起始溫度70℃，停留5 min后以60℃/min升溫至320℃。

1.2.4 樣品前處理

稱取樣品3.00 g于50 mL容量瓶中，加30 mL水振搖，超聲20 min后定容。從容量瓶中吸取10 mL溶液于50 mL離心管中冰浴5 min后，加入正庚烷5.00 mL，亞硝酸鈉溶液，硫酸溶液各2.5 mL。搖勻，在冰浴中放置30 min，并經(jīng)常搖動，取出置于50℃熱水浴中加入氫氧化鈉溶液，調至pH 10，30 min后將試液冷卻至25℃，加入2.5 g氯化鈉，搖勻后置渦旋混合器上振動1 min（或振搖80次），待靜置分層后取上層清液進行氣相色譜分析。

1.2.5 水解條件的優(yōu)化

環(huán)己醇亞硝酸酯能否順利轉化環(huán)己醇在于水解過程，此過程主要由兩個因素影響，分別是pH值和水解溫度。水解 pH 值選擇：8、9、10、11、12、13；水解溫度選擇：30、40、50、60、70、80 ℃。優(yōu)化試驗前處理按照1.2.4，固定其它條件，以某一水解條件為變量，通過測定目標物回收率，比較不同水解條件對結果的影響，從而選擇最佳試驗條件。

2 結果與分析

2.1 水解條件的優(yōu)化

2.1.1 水解pH值的選擇

不同pH值下測出的甜蜜素回收率見圖1。

圖1 甜蜜素回收率隨水解pH值的變化Fig.1 Change of sodium cyclamate recovery rates in different hydrolytic pH

由圖1可以看出，甜蜜素回收率先隨pH值的增加而增加，在pH值為10處達到最大，后隨pH值增加而降低。即在pH值為10的條件下，甜蜜素的回收率最高，因此確定用于水解的最適pH值為10。

2.1.2 水解溫度的選擇

不同溫度下甜蜜素回收率見圖2。

圖2 甜蜜素回收率隨水解溫度的變化Fig.2 Change of sodium cyclamate recovery rates in different hydrolytic temperatures

由圖2可以看出，甜蜜素回收率先隨溫度的增加而增加，在溫度為50℃處達到最大，后隨溫度的增加而降低。即在溫度為50℃的條件下，甜蜜素的回收率最高，因此確定用于水解的最適溫度為50℃。

2.2 水解法標準曲線的配制

準確移取1.00 mg/mL環(huán)己基氨基磺酸標準溶液0.50、1.00、2.50、5.00、10.0、25.0 mL 于 50 mL 容量瓶中，加水定容后續(xù)步驟同1.2.3，配成標準溶液系列濃度：0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL。標準曲線見圖3，得到的線性方程為：y=174.43x-0.040 93，相關系數(shù)R2=0.999 6。

圖3 水解法標準曲線Fig.3 The standard curve in hydrolytic method

2.3 國標法與水解法的準確度與精密度比較

根據(jù)國標法和本試驗方法的操作步驟，分別對市場上銷售的4種樣品進行處理，并進行準確度和精密度的比較分析見表1。

表1 兩種方法測定結果的準確度與精密度比較（n=10）Table 1 The accuracy and precision of two methods in the study

從表1可以看出，國標法對4種不同樣品的回收率在87.0%～98.6%之間，相對標準偏差在3.26%～5.22%之間，而水解法對4種不同樣品的回收率在94.0%～104.0%之間，相對標準偏差在3.02%～4.75%之間。由此可以得出，水解法的準確度和精密度均比國標法好。

2.4 水解法的檢出限與定量限

以目標峰高等于3倍基線噪音為檢出限，等于10倍基線噪音為定量限。試驗結果證明，在稱樣量為3.00 g，添加量為24 μg時，信噪比等于3，添加量為81 μg時信噪比等于10。因此，水解法的檢出限與定量限分別為 0.008、0.027 g/kg，均優(yōu)于國標法。

3 結論

本試驗在國標方法的基礎上增加水解步驟，通過測定水解后環(huán)己醇含量，間接準確測定甜蜜素含量。結果表明，樣品經(jīng)水解后用氣相色譜法測定食品中甜蜜素含量的最適試驗條件為：水解pH 10，水解溫度50℃。該方法前處理簡單、易操作、快速、可靠，為甜蜜素的測定方法提供更多選擇。