生料液態(tài)釀酒工藝研究與品質(zhì)檢測(cè)

王端好，王震，胡吉祥，韓孟姚，仲杰

（黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000）

生料液態(tài)釀酒就是小曲中微生物在液態(tài)中將谷物淀粉先糖化，后發(fā)酵生成酒精和香味香氣物質(zhì)的過(guò)程[1]。在釀酒過(guò)程中，產(chǎn)胞外水解酶的微生物利用自身代謝所產(chǎn)生的酶將生淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖，將蛋白質(zhì)水解為氨基酸等。在無(wú)氧的情況下，葡萄糖進(jìn)入酵母菌細(xì)胞后代謝生成乙醇，并排出細(xì)胞外，在相關(guān)酶的作用下，產(chǎn)生一些香味香氣成分[2-4]。與傳統(tǒng)熟料工藝相比，可以節(jié)約能源，提高出酒率。由于是在液態(tài)下發(fā)酵，具有操作簡(jiǎn)便，便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[5-8]。

清香型白酒香味醇厚而持久，無(wú)其它雜味，顏色清亮、透明，口感柔和、協(xié)調(diào)，入口軟而甜、清爽、干凈，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[9]。大米中除含有70%～80%的淀粉之外，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維和小分子氨基酸等成分[10-11]，適合作為釀酒原料。我國(guó)作為世界上第一大米生產(chǎn)國(guó)，利用大米釀酒可以釀造出具有米香味的清香型白酒，同時(shí)提高大米的附加值。

本文擬研究以大米為釀酒原料，以小曲為糖化發(fā)酵劑，用生料液態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵生產(chǎn)清香型大米酒生產(chǎn)工藝，并對(duì)酒質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，此研究在現(xiàn)有文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小曲：黃淮學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室自制；大米：市售，粉碎至通過(guò)網(wǎng)孔2 mm的網(wǎng)篩；鹽酸（分析純）：佛山市華希盛化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（BCD-252KU）：河南新飛電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RH52-3）：上海滬西分析儀器廠有限公司；酒度計(jì)（BL501）：深圳市博萊森電子科技有限公司；氣相色譜儀（GC-2014）：日本島津公司；酒精發(fā)酵罐（GD-FJ-100L）：溫州古德輕工機(jī)械有限公司；蒸餾器（D35L）：家多寶釀酒機(jī)械；網(wǎng)篩：浙江上虞五四儀器篩具廠。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

按照大米、水和小曲 100∶300∶0.8（質(zhì)量比）的比例，在30℃下錐形瓶中密閉發(fā)酵12 d，從第2天開(kāi)始到第5天，每天定時(shí)打開(kāi)錐形瓶的密封口用玻璃棒兩次攪拌然后再密封；從第3天開(kāi)始，每天定時(shí)檢測(cè)一次發(fā)酵液的酒精度；從第6天開(kāi)始密閉發(fā)酵。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵溫度、小曲添加量和培養(yǎng)基初始pH值3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化發(fā)酵溫度時(shí)，固定小曲添加量為0.8%（以大米為100 g計(jì)），培養(yǎng)基初始pH值為7，以發(fā)酵溫度為變量，以酒精含量為指標(biāo)，選擇最佳發(fā)酵溫度；優(yōu)化小曲添加量時(shí)，固定發(fā)酵溫度為30℃，培養(yǎng)基初始pH值為7，以小曲添加量為變量，以酒精含量為指標(biāo)，選擇最佳小曲添加量；優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH值時(shí)，固定發(fā)酵溫度為30℃，小曲添加量為0.8%，以培養(yǎng)基初始pH值為變量，以酒精含量為指標(biāo)，選擇最佳初始pH值。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵溫度、小曲添加量和培養(yǎng)基初始pH值運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以酒精含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1[12]。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[13]。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Experimental factors and levels in Box-Behnken

1.3.4 小試放大試驗(yàn)

按照響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，在100 L的帶有攪拌器的厭氧發(fā)酵罐中進(jìn)行小試放大生產(chǎn)大米酒。從第2天開(kāi)始到第5天每天定時(shí)打開(kāi)發(fā)酵罐，進(jìn)行攪拌和換氣兩次，然后密封，從第6天開(kāi)始密閉發(fā)酵。

1.3.5 酒精檢測(cè)

取發(fā)酵液100 mL，添加50 mL去離子水混勻，進(jìn)行蒸餾，蒸餾溫度75℃，當(dāng)餾出液為20 mL時(shí)停止蒸餾，用酒度計(jì)檢測(cè)酒精含量。

1.3.6 酒質(zhì)檢測(cè)

測(cè)定甲醇含量的方法參考GB 5009.266—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測(cè)定》；測(cè)定乙酸乙酯含量的方法參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度對(duì)釀酒結(jié)果影響顯著，溫度對(duì)生物體內(nèi)的一系列生物化學(xué)反應(yīng)影響重大，對(duì)酶的種類和活性影響也較大，從而影響酶促反應(yīng)速率和方向，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量，最適溫度促進(jìn)微生物的良好生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物的合成[14]。不同發(fā)酵溫度對(duì)酒精含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酒精含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content

如圖1所示，在3 d～11 d期間，各組酒精含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增大，到第12天時(shí)，酒精含量未明顯增加。發(fā)酵溫度為15、20℃時(shí)，發(fā)酵液中的酒精含量均較低。當(dāng)發(fā)酵溫度分別為25、30、35℃時(shí)，酒精含量均較高，發(fā)酵液中的微生物的代謝速度快，產(chǎn)酒的速度也快。發(fā)酵溫度為30℃時(shí)發(fā)酵液中的酒精含量最高，所以取最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.1.2 小曲添加量的影響

小曲是釀酒的糖化發(fā)酵劑[15]，曲中含有很多種菌種，其中最主要的是霉菌，以根霉為主的小曲，酒化力最強(qiáng)，因此用它作為糖化發(fā)酵劑用量很少，而且發(fā)酵期短、出酒率高[16]。不同小曲添加量對(duì)酒精含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 小曲添加量對(duì)酒精含量的影響Fig.2 Effect of addition of xiaoqu on alcohol content

如圖2所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的酒精含量均逐漸增大；當(dāng)小曲添加量為0.4%和0.6%時(shí)，發(fā)酵液中的酒精含量較低。當(dāng)小曲添加量為0.8%、1.0%和1.2%時(shí)，發(fā)酵液中的酒精含量較高。小曲添加量為1.0%時(shí)，酒精含量最高。小曲添加量高，酒曲的用量大，糖化發(fā)酵劑的量增大，糖化發(fā)酵速度快，但在一定條件下，小曲添加量過(guò)大時(shí)，由于微生物在糖化發(fā)酵初期生長(zhǎng)速率過(guò)大，導(dǎo)致局部缺氧，反而使糖化不徹底，酒精生成量降低，導(dǎo)致出酒率降低。故此取最佳小曲添加量為1.0%。

2.1.3 培養(yǎng)基初始pH值的影響

培養(yǎng)基的pH值影響微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶的活性，從而影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量[17]。培養(yǎng)基不同初始pH值對(duì)酒精含量的影響見(jiàn)圖3。

如圖3所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的酒精含量均逐漸增大；培養(yǎng)基初始pH值為6時(shí)，酒精度最高，培養(yǎng)基初始pH值為5和7時(shí)，酒精含量較低。每一類微生物都有其特定的耐受和最適pH值范圍，在最佳pH值的范圍內(nèi)能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，以獲得較高的產(chǎn)量。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為6時(shí)，促進(jìn)了小曲內(nèi)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)了產(chǎn)物的合成，獲得最高產(chǎn)量。所以取培養(yǎng)基最佳初始pH值為6。

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)酒精含量的影響Fig.3 Effect of initial pH of medium on alcohol content

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

按照Box-Behnken試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)了27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and responses in Box-Behnken

由表2得出二次回歸方程式為Y=-130.631 25+1.345 83A-4.145 83B+50.275 00C-0.125 00AB+9.325 87×10-6AC+0.625 00BC-0.019 917A2+4.739 58B2-4.241 67C2。

計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，以這些回歸系數(shù)建立酒精含量（Y）與A發(fā)酵溫度、B小曲添加量和C培養(yǎng)基初始pH值3個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸模型。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面回歸方程解析Table 3 Response surface regression equation analysis

由表3可知，模型的一次項(xiàng)A影響高度顯著，B影響極顯著，C影響不顯著。從F值可以看出，單因素對(duì)酒精含量的影響順序依次是A>B>C，即發(fā)酵溫度>小曲添加量>初始pH值。二次項(xiàng)C2影響高度顯著，A2影響極顯著，B2影響不顯著。交互項(xiàng)影響不顯著。從整體分析，模型P<0.000 1，表明該二次多項(xiàng)回歸模型高度顯著，失擬項(xiàng)P不顯著，表明模型與實(shí)際情況擬合較好。因此可以采用此模型對(duì)大米酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

對(duì)A發(fā)酵溫度、B小曲添加量、C培養(yǎng)基初始pH值3因素兩兩作交互作用分析，其響應(yīng)面見(jiàn)圖4。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[18]。

由圖4可知，發(fā)酵溫度和小曲添加量、培養(yǎng)基初始pH值和小曲添加量之間交互作用顯著。

圖4 響應(yīng)面法各因素交互作用分析Fig.4 Analysis of interaction of various factors by response surface methodology

通過(guò)對(duì)以上獲得的二次方程回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析可知，以大米為原料，生料液態(tài)釀酒最優(yōu)工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度30.02℃、小曲添加量1.2%、培養(yǎng)基初始pH值6.01，在此優(yōu)化條件下，酒精含量理論值為42.6197°。為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面分析結(jié)果的可靠性，為方便實(shí)際操作，選擇發(fā)酵溫度30℃、小曲添加量為1.2%、培養(yǎng)基初始pH值6作為最優(yōu)條件。重復(fù)3次，測(cè)得酒精含量分別為 42.608 8、42.610 5、42.609 9 °，取平均值為42.609 7°。與理論值相比，相對(duì)誤差較小。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的生料液態(tài)釀酒工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可進(jìn)行下一步放大試驗(yàn)。

2.3 小試放大試驗(yàn)結(jié)果

在100 L發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行小試放大試驗(yàn)。發(fā)酵到第3天就開(kāi)始產(chǎn)生氣體，到了第5天發(fā)酵液就發(fā)出較為強(qiáng)大的酒香味，發(fā)酵10 d后，發(fā)酵液上面一層顏色變深，第12天發(fā)酵液上面一層變?yōu)榭Х壬?，下罐。用蒸酒器蒸餾，去酒頭和酒尾，然后進(jìn)行調(diào)制，出酒率達(dá)到每100 kg大米生產(chǎn)出50°白酒109.5 kg。酒體清亮、透明，入口柔和、協(xié)調(diào)，并具有大米的清香味。

2.4 酒質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)發(fā)酵試驗(yàn)生產(chǎn)出的原漿50°成品酒進(jìn)行品評(píng)，具有“清香醇厚、綿柔回甜、尾凈爽口、回味悠長(zhǎng)”的特點(diǎn)，同時(shí)還具有大米特有的清香味。

酒體中最重要的香味物質(zhì)是乙酸乙酯，乙酸乙酯的含量決定了酒體的質(zhì)量，而甲醇卻是有害物質(zhì)，含量過(guò)高會(huì)對(duì)人體造成傷害，所以甲醇在酒體中的含量要低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，需要對(duì)成品酒中的乙酸乙酯和甲醇的含量進(jìn)行鑒定分析。用氣相色譜檢測(cè)的圖譜見(jiàn)圖5，氣相色譜檢測(cè)結(jié)果分析見(jiàn)表4，成品酒鑒定結(jié)果見(jiàn)表5。

圖5 氣相色譜檢測(cè)圖譜Fig.5 Gas chromatographic detection atlas

表4 氣相色譜檢測(cè)結(jié)果分析Table 4 Analysis table of gas chromatography detection results

表5 成品酒鑒定結(jié)果Table 5 The detection results of the wine

由此可知，成品酒中乙酸乙酯含量為0.43 g/L，根據(jù)GB/T 10781.2—2006《清香型白酒》的標(biāo)準(zhǔn)，該成品酒符合國(guó)家一級(jí)白酒的標(biāo)準(zhǔn)；甲醇含量?jī)H為0.08 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量安全。因此該大米酒符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可有計(jì)劃的大力推廣生產(chǎn)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)面分析，建立了發(fā)酵生產(chǎn)大米酒中含量酒精的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)酒精產(chǎn)量。確定小曲生料液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大米清香型白酒的最終優(yōu)化工藝參數(shù)：發(fā)酵溫度30℃、小曲添加量1.2%、培養(yǎng)基初始pH值為6。在發(fā)酵罐進(jìn)行小試發(fā)酵12 d時(shí)50°白酒出酒率達(dá)到109.5%，出酒率高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)量。

該大米酒酒體清亮、透明，入口柔和、協(xié)調(diào)，并具有大米的清香味。通過(guò)氣相色譜檢測(cè)，乙酸乙酯含量為0.43 g/L，符合國(guó)家一級(jí)清香型白酒的標(biāo)準(zhǔn)；甲醇含量?jī)H為0.08 g/L，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量安全。該產(chǎn)品成本低，勞動(dòng)強(qiáng)度小，出酒率高，產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)，為下一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。