退化高寒草甸土壤細(xì)菌群落特征對補播的響應(yīng)研究

尹亞麗，劉 穎,2，李世雄,2*

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.省部共建三江源區(qū)高寒草地生態(tài)教育部重點實驗室,青海大學(xué),青海 西寧 810016)

高寒草甸是在寒冷的環(huán)境下由青藏高原隆升后，特化形成的一種高寒植被類型，其植被物種豐富，群落結(jié)構(gòu)簡單，草層低矮，草質(zhì)優(yōu)良，為良好的天然牧場。近年來，受全球氣候變化與人類活動的共同影響[1]，加之不合理的放牧管理和家畜數(shù)量與草地資源的不當(dāng)匹配，使得草地嚴(yán)重超載，草地環(huán)境日益惡化，大面積的優(yōu)良草地出現(xiàn)不同程度退化[2]。草地退化，地面覆蓋度降低，土壤侵蝕、水土流失，草地生產(chǎn)力下降，生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，其不僅阻礙了牧區(qū)社會、經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，還嚴(yán)重威脅到長江流域和黃河中下游地區(qū)的生態(tài)平衡與人類的生存發(fā)展[3]。補播是退化草地快速恢復(fù)治理的有效途徑之一[4-5]，通過播種適宜草種來調(diào)整草地群落結(jié)構(gòu)，加強優(yōu)良牧草競爭優(yōu)勢，以提高草地生產(chǎn)力和優(yōu)質(zhì)牧草比例，調(diào)節(jié)草地植被物種組成，提高草層高度，擴大草地植被蓋度。

土壤細(xì)菌作為土壤微生物中含量最多、豐度最高的類群，具有最為豐富的遺傳多樣性，促進營養(yǎng)物質(zhì)釋放、有機質(zhì)的分解，參與C、N等物質(zhì)循環(huán)過程[6-7]，在土壤生態(tài)過程中有著不可或缺的地位。然而，微生物生命周期短暫，其結(jié)構(gòu)和功能對生存的微環(huán)境極其敏感，可對環(huán)境變化做出快速反應(yīng)[6,8]。退化草地補播修復(fù)，原有的土壤微環(huán)境受到擾動，土壤質(zhì)量和養(yǎng)分循環(huán)發(fā)生根本改變，逐漸形成了與之相適應(yīng)的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)并發(fā)揮其相應(yīng)功能[9]。近五年來，有關(guān)學(xué)者對土壤中微生物的原位生存狀態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法很難全面地估計土壤中微生物群落多樣性，從土壤中簡單提取、培養(yǎng)的方法只能反映極少數(shù)微生物的信息[10]，隨著高通量基因檢測技術(shù)的發(fā)展與成熟，為生態(tài)系統(tǒng)中微生物的研究提供了新的手段。鑒于此，本研究采用高通量基因檢測技術(shù)，對補播措施下高寒草甸土壤細(xì)菌群落特征進行研究，明確土壤細(xì)菌群落組成、結(jié)構(gòu)及功能對補播措施的響應(yīng)規(guī)律，以期為退化草地恢復(fù)治理提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于青海省果洛藏族自治州瑪沁縣大武鎮(zhèn)(100°12′49.6″ E，34°27′51.9″ N，海拔約3 740 m)，屬典型高原大陸型氣候，干旱、多風(fēng)，太陽輻射強，日照時間短，晝夜溫差大。年均氣溫-3.9 ℃，最冷月平均氣溫為-12.6 ℃，最熱月平均氣溫為9.7 ℃，冷季長、暖季短。年降水量513.2～542.9 mm，主要集中于5—9月，年蒸發(fā)量2 471.6 mm。牧草生長季約150 d，全年無絕對無霜期。草地為高寒矮嵩草(Kobresiahumili) 草甸，退化草地主要植物有莎草科、禾本科、菊科、龍膽科、薔薇科、豆科及雜類草等；土壤為高山草甸土。

1.2 試驗方法

參照馬玉壽等[11]的分類標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)草地植被覆蓋度、可食牧草及毒害草比例和草場質(zhì)量等指標(biāo)，將草地評定為中度退化草地。2006年利用青海草地早熟禾對中度退化草地進行補播處理，播種量3.75 kg/hm2，并以150 kg/hm2施用尿素，補播后未進行后續(xù)改良。2016年5月，在中度退化(Moderate-degradation，MD；MD-1和MD-2分別代表該草地0～10 cm和10～20 cm土層)及補播草地(Reseeding，RS；RS-1和RS-2分別代表該草地0～10 cm和10～20 cm土層)，各劃定4個試驗小區(qū)為重復(fù)，每小區(qū)面積約200 m2。2017年8月，采用蛇形取樣法，以直徑3.5 cm的根鉆在各小區(qū)采集0～10 cm 和10～20 cm土樣，每小區(qū)5～8鉆分層混合為1個土樣，過2 mm篩，撿除枯物、石粒及植物根系等，裝入自封袋，4 ℃運回實驗室，充分混勻后裝入10 mL離心管，干冰運輸至廣州基迪奧生物科技有限公司進行Metagenomic測序，測序和生物信息服務(wù)在Illumina PE250平臺完成。

采用HiPure Soil DNA Mini Kit ( Magen公司，中國廣州) 提取土壤DNA。取2 μL DNA樣品，采用NanoDrop微量分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo Fisher，USA)測定核酸的吸光度，檢測核酸的純度。采用瓊脂糖(1% agarose)凝膠電泳檢測核酸樣品的完整性和蛋白污染程度。取2 μL DNA樣品，采用Qubit熒光定量(Qubit 3.0，Thermo Fisher，USA)檢測每一個樣品的DNA濃度，并根據(jù)濃度計算樣品DNA總量。采用微生物Marker基因高通量測序評估土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，細(xì)菌檢測區(qū)為16S rRNA基因的V3+V4區(qū)。

測序得到的Raw reads通過過濾、Tags拼接、過濾、去嵌合體，對N50、N90 Tags由長到短加和，最終在有效Tags樣本中隨機選取(8.0～9.2)×104Tags開展OTU (operational taxonomic units)聚類分析。用Uparse軟件對所有樣品的全部有效Tags序列聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs結(jié)果，并計算出每個OTU在各個樣品中的Tags絕對豐度和相對信息。采用Silva (Quast et al，2013)數(shù)據(jù)庫進行物種注釋(設(shè)定置信度的閾值為0.8～1.0)，并根據(jù)注釋信息統(tǒng)計每個樣品在各個分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)上的Tags序列數(shù)目?；贠TUs計數(shù)統(tǒng)計，利用Bray-Curtis距離系數(shù)分析土壤細(xì)菌群落差異，采用Faprotax數(shù)據(jù)庫對土壤細(xì)菌生態(tài)功能進行預(yù)測。

1.3 測定指標(biāo)

(1)Chao1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中用來估計物種總數(shù)。Chao1=Sobs+F1(F1-1)/2(F2+1)，式中：Sobs表示樣本中觀察到OTU數(shù)目，F(xiàn)1是樣本中數(shù)量只為1的OTU數(shù)目(稱為Singleton)，F(xiàn)2是樣本中數(shù)量只為2的OTU數(shù)目(稱為Doubleton)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理及單因素(one-way ANOVA)和T檢驗(α=0.05)，Spass 17.0進行Wilcoxon秩和檢驗，采用R 3.5.2進行細(xì)菌物種組成、群落多樣性及PCoA分析；利用Excel 2010和R 3.5.2軟件作圖，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 補播對土壤細(xì)菌物種組成的影響

本試驗從補播及退化草地土壤樣品中讀取的細(xì)菌序列屬于10個門，包括浮霉菌門(Planctomycetes) 、酸桿菌門 (Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)(圖1)。

由圖1可知，浮霉菌門、變形菌門、疣微菌門、酸桿菌門和放線菌門為退化及補播草地土壤優(yōu)勢細(xì)菌，五者在土壤細(xì)菌中占比超過75%。0～10 cm土層，浮霉菌門、變形菌門、疣微菌門、酸桿菌門和放線菌門優(yōu)勢細(xì)菌相對豐度在退化及補播草地分別為15%和30%、22%和17%、13%和 15%、23%和16%、10%和7%。T檢驗結(jié)果顯示，酸桿菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門細(xì)菌相對豐度在退化草地和補播草地間差異顯著(P<0.05)；10～20 cm土層，上述五者優(yōu)勢細(xì)菌在退化及補播草地分別為18%和27%、17.4%和16.7%、11%和 13%、20%和19%、9%和6%。兩草地門水平土壤細(xì)菌T檢驗結(jié)果顯示，綠彎菌門、硝化螺旋菌門和擬桿菌門細(xì)菌豐度在兩草地間顯著差異。即補播后優(yōu)勢細(xì)菌浮霉菌門、疣微菌門相對豐度升高，酸桿菌門、變形菌門和放線菌門相對豐度降低，補播改變了草地土壤細(xì)菌物種組成，且同一草地不同土層土壤細(xì)菌物種存在差異。

圖1 補播及退化草地土壤細(xì)菌門水平相對豐度Fig.1 Relative abundance of soil bacteria phylum level in reseeding and degraded grassland

2.2 補播對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

表1為補播對草地土壤細(xì)菌群落多樣性的變化。由表1可知，退化及補播草地0～10 cm土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)均高于10～20 cm。在0～10 cm土層，補播后草地土壤細(xì)菌Simpson指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)無明顯變化；在10～20 cm土層，補播草地土壤細(xì)菌Shannon和Simpson指數(shù)指數(shù)均顯著升高，其中Shannon指數(shù)升高0.34，而Chao1指數(shù)在兩草地間無顯著差異(P>0.05)。即補播對草地表土層土壤細(xì)菌多樣性影響較小，而對下土層土壤細(xì)菌多樣性影響較大。

表1 補播對退化草地土壤細(xì)菌群落多樣性的影響Tab.1 Effects of reseeding on the diversity of soil bacterial community in degraded grassland

2.3 補播對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

采用Bray距離對草地土壤細(xì)菌OTU進行主坐標(biāo)分析(PCoA)，由圖2可知，PCo1對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的解釋度為46.45%，PCo2的解釋度為16.73%，兩軸解釋度總和達63.18%。Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果顯示，同一草地不同土層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著差異(P<0.05)。在0～10 cm土層，退化草地與補播草地間土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異極顯著(P<0.01)；在10～20 cm土層，不同草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無明顯差異(P=0.06>0.05)。即補播改變了草地表土層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 補播對退化草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of reseeding on the structure of soil bacterial community in degraded grassland

2.4 補播對土壤細(xì)菌功能結(jié)構(gòu)的影響

采用Faprotax對補播草地和退化草地土壤細(xì)菌群落進行生態(tài)功能預(yù)測，在退化及補播草地共注釋功能菌62種，其中0～10 cm土層有47種在不同草地間表現(xiàn)差異；10～20 cm土層有59種在不同草地間表現(xiàn)差異(P<0.05)。對豐度前十的功能菌進行分析，由圖3、圖4可知，化能異養(yǎng)(包含有氧化能異養(yǎng))、硝化作用、亞硝酸鹽氧化及硫代謝作用細(xì)菌在草地土壤中起主要功能調(diào)節(jié)作用。T檢驗結(jié)果顯示，在0～10 cm土層，硝化作用、亞硝酸鹽氧化作用、硫及硫化物呼吸作用和動物寄生共生作用細(xì)菌在退化及補播草地間差異顯著(P<0.05)；在10～20 cm土層，化能異養(yǎng)作用、有氧化能異養(yǎng)、硝化作用、亞硝酸鹽氧化作用、動物寄生共生作用、芳香族化合物降解作用及硝酸鹽還原作用細(xì)菌在退化及補播草地間差異顯著(P<0.05)。

注：*表示兩草地間差異顯著，下同?；墚愷B(yǎng)(chemoheterotrophy)；有氧化能異養(yǎng)(aerobic chemoheterotrophy)；硝化作用(nitrification)；亞硝酸鹽氧化(aerobic nitrite oxidation);氨氧化作用(aerobic ammonia oxidation);硫化物呼吸(respiration of sulfur compounds)；硫呼吸作用(sulfur respiration)；動物寄生-共生作用(animal parasites or symbionts)；芳香族化合物降解(aromatic compound degradation)；尿解作用(ureolysis)；下同。圖3 補播對0～10 cm土層土壤細(xì)菌群落功能結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of reseeding on the functional structure of soil bacterial community in 0～10 cm soil layer

注：硝酸鹽還原(nitrate reduction)。圖4 補播對10～20 cm土層土壤細(xì)菌群落功能的影響Fig.4 Effects of reseeding on the functional structure of soil bacterial community in 10～20 cm soil layer

3 討論與結(jié)論

土壤微生物是土壤中一切生態(tài)功能的媒介[12]，作為草地地下生態(tài)系統(tǒng)最大的資源庫，是土壤有機質(zhì)和土壤養(yǎng)分等在土壤和大氣圈雙向循環(huán)和轉(zhuǎn)化中的主要推動力，其生命周期短，對生存的微環(huán)境十分敏感，能對土壤生態(tài)變化和環(huán)境脅迫做出快速反應(yīng)[13-15]。本研究表明，退化高寒草甸補播后草地土壤細(xì)菌物種組成發(fā)生明顯改變，補播草地土壤浮霉菌門和疣微菌門細(xì)菌相對豐度升高，酸桿菌門、變形菌門和放線菌門細(xì)菌相對豐度降低。補播對草地表土層土壤細(xì)菌多樣性影響較小，而對下土層細(xì)菌多樣性影響較大。造成此結(jié)果的原因可能是因補播改變了退化草地地上植被物種組成，土壤中有機物質(zhì)輸入及土壤性質(zhì)發(fā)生相應(yīng)變化，加之土壤生物競爭、對物理和生物環(huán)境的擾動適應(yīng)性等因素的共同作用[16-17]，導(dǎo)致土壤細(xì)菌物種組成及群落多樣性發(fā)生變化。

同一草地不同土層間土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異不顯著；但是在同一土層不同草地間土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)顯著差異，補播改變了草地0～10 cm土層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)?；墚愷B(yǎng)(包含有氧化能異養(yǎng))、硝化作用、亞硝酸鹽氧化及硫代謝作用細(xì)菌在草地土壤中起主要功能調(diào)節(jié)作用，補播改變了退化草地土壤細(xì)菌功能結(jié)構(gòu)。包明等[18]研究指出硝化作用、化能異養(yǎng)作用、氨氧化作用、亞硝酸鹽氧化及硝酸鹽還原作用功能類細(xì)菌在土壤中具有較高的豐度，這與本研究結(jié)果基本一致。補播后草地土壤亞硝酸鹽氧化作用細(xì)菌顯著減少，這一結(jié)果可能與微生物物種組成改變有關(guān)，新的優(yōu)勢物種與相關(guān)功能物種存在種間協(xié)同-競爭；同時與土壤性質(zhì)變化有關(guān)，土壤性質(zhì)的變化引致微生物生存環(huán)境改變[19-21]。此外，地上植被組成的改變可能會影響某些土壤微生物群落的發(fā)展和種群組成[22]，土壤凋落物投入的改變導(dǎo)致微生物底物有效性的變化。Yang等[15]研究也指出土壤微生物群落功能結(jié)構(gòu)的變化主要受地上植被、土壤碳氮比和銨態(tài)氮含量的控制。由此可知補播改變了退化高寒草甸土壤細(xì)菌群落及功能結(jié)構(gòu)。