棉花枯萎病菌新生理型菌株毒素鑒定及其活性測定

楊可心，陳秀葉，劉暢，鹿秀云，郭慶港*，馬平

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北 保定071000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，南京210095）

由尖孢鐮刀菌萎蔫?；停‵usarium oxysporumf.sp.vasinfectum）引起的棉花枯萎病是棉花生產(chǎn)上的主要病害之一，給棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[1]。種植抗病品種是防治棉花枯萎病的有效措施之一[2]，但近年來田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，棉花枯萎病發(fā)生提前，并且存在越來越重的趨勢，推測可能與病原菌的遺傳分化有關(guān)。

根據(jù)在不同寄主上的致病力強弱，棉花枯萎病菌被劃分為8個不同的生理小種，1號和2號生理小種分布在美國和坦桑尼亞[3]，3號生理小種分布在埃及、以色列、蘇丹和我國新疆的個別地區(qū)[4]；4號生理小種最初在印度被發(fā)現(xiàn)，2001年在美國的加州地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了1株強致病力棉花枯萎病菌，通過致病力測定和分子檢測技術(shù)，該菌株被鑒定為4號生理小種[5]。5號生理小種分布于蘇丹，對海島棉有侵染性，對陸地棉無侵染作用[6]；6號生理小種存在于巴西，其致病力與1、2號生理小種相似。7號和8號生理小種存在于中國，并且7號生理小種致病力較強，是我國的優(yōu)勢生理小種[7]。除了上述8個明確的生理小種外，在澳大利亞存在一類獨特的生理型菌株。澳大利亞生理型菌株致病力較強，對澳大利亞大部分棉花品種表現(xiàn)較強的致病力，給當(dāng)?shù)孛藁ㄉa(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。通過多基因序列比對發(fā)現(xiàn)，澳大利亞生理型菌株是由澳大利亞本土起源[8]。近年來，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，國內(nèi)外相繼分離出幾個具有不同遺傳背景的生理型菌株[9]。

尖孢鐮刀菌產(chǎn)生植物毒素導(dǎo)致植物萎蔫是其致病的主要機理之一。尖孢鐮刀菌可以產(chǎn)生多種植物毒素，包括鐮刀菌酸（Fusaric acid）、白僵菌素（Beauvericin）、苯乙酸（Phenylacetic acid）[10-11]，其中鐮刀菌酸是棉花枯萎病菌產(chǎn)生的主要毒素，引起棉花植株萎蔫癥狀，阻斷鐮刀菌酸合成后可以顯著降低棉花枯萎病菌的致萎能力[12-13]。棉花枯萎病菌不同生理小種之間毒素的種類以及鐮刀菌酸的產(chǎn)量不同[14]。

Guo等對采自我國主要植棉區(qū)的棉花枯萎病菌進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)我國棉花枯萎病菌存在不同于3號、7號和8號生理小種的新生理型菌株；進一步通過看家基因序列比對，證明這類新生理型菌株與澳大利亞生理型菌株親緣關(guān)系較近；致病力測定表明，新生理型菌株對我國主要的棉花品種致病力較弱[9]。本研究的目的包括：（1）明確棉花枯萎病菌新生理型菌株、7號生理小種以及澳大利亞生理型菌株產(chǎn)生的主要毒素種類以及產(chǎn)量差異；（2）采用離體葉片法評價毒素的致病力。本研究結(jié)果將進一步加深對新生理型菌株的了解，為新生理型菌株致病力長期監(jiān)測及防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花枯萎病菌新生理型H70菌株采自河北省威縣，通過擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）分析以及多基因序列比對，證明該菌株不同于我國已發(fā)現(xiàn)的3號、7號和8號生理小種，而與澳大利亞生理型菌株親緣關(guān)系較近[9]。7號生理小種由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室分離并保存提供，澳大利亞生理型菌株ATCC96291購自美國菌株保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 棉花枯萎病菌不同菌株形態(tài)學(xué)觀察

將棉花枯萎病菌7號生理小種、H70及澳大利亞生理型菌株ATCC96291菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（pH 5.5）上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，觀察不同菌株的形態(tài)。將3株棉花枯萎病菌在馬鈴薯葡萄糖液體（Potato dextrosebroth，PDB）培養(yǎng)基（pH 5.5）中，25℃、160 r·m in－1下震蕩培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)液在10000 r·m in－1下離心10min，觀察上清液的顏色。

1.3 棉花枯萎病菌不同菌株在不同溫度下生長情況比較

將供試菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在25℃條件下培養(yǎng)5 d，挑取菌落邊緣相同大小的菌餅于PDA培養(yǎng)基上，分別置于20℃、25℃、30℃和35℃溫度梯度下培養(yǎng)，每個溫度3次重復(fù)，7 d后利用十字交叉法測量菌落平均直徑，觀察菌株在不同溫度下的生長差異。

1.4 棉花枯萎病菌不同菌株孢子形態(tài)觀察

將供試菌株接種在綠豆湯培養(yǎng)基（pH 6.0）[15]中，25℃、160 r·m in－1下震蕩培養(yǎng)5 d，經(jīng)4層紗布濾去菌絲，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。

1.5 棉花枯萎病菌毒素的提取

將棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種和ATCC96291分別接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)7 d，切取菌落邊緣直徑為6 mm的菌餅，放入100 m L察氏培養(yǎng)基[16]中，25℃、120 r·min－1振蕩培養(yǎng)15 d。培養(yǎng)液4層紗布過濾，過濾液3 000 r·m in－1下離心30 m in。上清液再次用3層濾紙過濾，收集濾液。將濾液置于65℃水浴30 min，得到粗毒素。取粗毒素50 m L，用1 mol·L－1的HCl調(diào)pH至2.5，用10 m L乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機相。蒸干后的殘留物用色譜級甲醇溶解并調(diào)整質(zhì)量濃度為20 g·L－1，然后用孔徑為0.45μm的過濾器過濾得到毒素提取液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 毒素的高效液相色譜分析

利用Waters-2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）對毒素提取液進行分離、檢測。色譜柱為Agilent TC-C18（柱長250 mm，直徑4.6 mm，填料粒徑5μm），流動相A相為0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）K2HPO4·3H2O溶液（使用前，用濃H3PO4將其pH調(diào)節(jié)至7.34），流動相B相為甲醇。梯度洗脫程序：0～20 m in，流動相B從50%（體積分?jǐn)?shù)）逐漸提高到75%；20～25 m in，流動相B從75%逐漸降低到50%。流速為1 m L·m in－1，檢測波長為268 nm。鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為10～1 000 mg·L－1的系列稀釋液，按照質(zhì)量濃度從低到高的順序連續(xù)進樣，以進樣鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以檢測到的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。對3個菌株的毒素提取物進行液譜分析，根據(jù)峰面積大小計算每個菌株鐮刀菌酸的產(chǎn)量[17]。收集3個菌株毒素提取液中的特異性物質(zhì)，濃縮后進行質(zhì)譜鑒定。

1.7 毒素的質(zhì)譜分析

采用液質(zhì)聯(lián)用儀（Triple TOF 5600，美國AB公司）對毒素中特異性物質(zhì)進行鑒定。液相色譜柱為Shim-pack GIST C18（柱長100 mm，直徑2.1 mm，填料粒徑2μm），流動相A相為H2O，流動相B相為乙腈，洗脫條件為0～0.5 m in，流動相B為10%；0.5～1.5 m in，流動相B從10%提升到40%；1.5～2.5 m in，流動相B從40%升到95%；2.5～3.5 m in，流動相B為95%；3.5～3.6 m in，流動相B從95%降到10%；3.6～5.0 m in，流動相B為10%。流速：0.4 m L·m in－1，柱溫：40℃，進樣量：2μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源（Elaectrospray ionization，ESI），正離子掃描方式；檢測方式為飛行時間全掃描質(zhì)譜和二級質(zhì)譜（TOF MS IDA MS-MS）模式。電噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為500℃。TOF-MS掃描范圍的質(zhì)核比（m/z）為20～500；觸發(fā)二級掃描范圍的m/z為30～500。

1.8 棉花枯萎病菌粗毒素對棉花葉片的致萎能力

采集健康一致的棉花葉片（冀棉11，對枯萎病敏感品種），用清水沖洗干凈。將棉花葉片置于含有水瓊脂的培養(yǎng)基中，用無菌針頭將葉片刺破，每個傷口滴加20μL（20 g·L－1）的粗毒素。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)，3 d后測量病斑面積。設(shè)置20 g·L－1的鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，甲醇為陰性對照，每個處理4個重復(fù)[18]。

1.9 不同類型土壤中棉花枯萎病菌致病力測定

分別從河北省保定市定興縣、邯鄲市成安縣和滄州市黃驊市的棉田中采集淺層土（去除表層土后，采集地下20 cm以內(nèi)的土壤）。土壤樣品的理化性質(zhì)（pH、電導(dǎo)率及有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、速效鉀、速效磷含量）由青島橫立檢測有限公司測定。將供試土壤和蛭石過篩按體積比1∶1充分混勻，121℃滅菌1 h，晾涼后再重復(fù)滅菌1次。將棉花枯萎病菌孢子懸浮液與土壤充分混勻，使土壤中孢子的含量達到106g－1。冀棉11種子經(jīng)表面消毒后，于25℃下催芽，將露白的棉種播種到混有枯萎病菌的培養(yǎng)基質(zhì)中，25℃恒溫室內(nèi)培養(yǎng)（12 h光照，12 h黑暗）。播種20 d后調(diào)查棉花枯萎病的發(fā)病情況，計算病情指數(shù)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花枯萎病菌培養(yǎng)性狀比較

比較了H70、7號生理小種和ATCC96291在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)差異。結(jié)果表明，7號生理小種和H70均能形成明顯的氣生菌絲，而ATCC96291氣生菌絲較少（圖1）。在PDB培養(yǎng)基上25℃、160 r·m in－1震蕩培養(yǎng)5 d后，7號生理小種產(chǎn)生淡褐色（紫色）的色素，但H70和ATCC96291均沒有色素產(chǎn)生，且7號生理小種培養(yǎng)液的上清液呈淡粉色，H70和ATCC96291的上清液均無色素產(chǎn)生（圖2）。

圖1 棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種（Race7）、ATCC96291的氣生菌絲觀察Fig.1 Aerial hypha of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum

圖2 棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種（Race7）、ATCC96291的菌落形態(tài)及上清液觀察Fig.2 Morphology and supernatantof strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum

進一步比較了H70、7號生理小種和ATCC96291在不同溫度下的生長情況。結(jié)果表明，3個菌株在25～30℃生長最好，7 d后菌落直徑達到3.4～4.2 cm，在35℃下不能生長。在20℃下，7號生理小種生長較快，而H70生長較慢；但在25℃和30℃下，H70和ATCC96291菌株生長較快，7號生理小種生長較慢（圖3）。

2.2 3株棉花枯萎病菌孢子形態(tài)比較

觀察3株棉花枯萎病菌在綠豆湯培養(yǎng)基中形成的孢子形態(tài)，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，7號生理小種形成的分生孢子以雙核小型孢子為主，孢子大小為（10～15）μm×（3～5）μm，存在少數(shù)多核大型孢子[（30～35）μm×（3～5）μm）]。H70菌株形成的分生孢子均為單核的小型分生孢子，孢子大小為（10～15）μm×（3～5）μm。而ATCC96291菌株形成的分生孢子均為大型分生孢子，孢子多核，大小為（30～35）μm×（3～5）μm。

圖3 棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種、A TCC96291菌株在不同溫度下生長情況Fig.3 Grow th of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum under different temperatures

圖4 棉花枯萎病菌7號生理小種、H70、ATCC96291菌株的孢子形態(tài)觀察Fig.4 The morphological features of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

2.3 3株棉花枯萎病菌毒素的色譜分析

利用液相色譜對棉花枯萎病菌新生理型菌株H70、7號生理小種和ATCC96291的毒素提取液進行分析。結(jié)果（圖5）顯示，3個菌株的毒素提取物中均存在1種特異性物質(zhì)，保留時間為6.5 min，且該特異性物質(zhì)與鐮刀菌酸具有相似的保留時間。由此推斷，3個菌株均產(chǎn)生鐮刀菌酸。

2.4 3株棉花枯萎病菌毒素的質(zhì)譜分析

以鐮刀菌酸作為對照，進一步利用液質(zhì)聯(lián)用儀對3株枯萎病菌中經(jīng)液譜分離獲得的特異性物質(zhì)進行質(zhì)譜分析。結(jié)果（圖6）顯示，H70、7號生理小種和ATCC96291毒素提取液中的特異性物質(zhì)m/z均為180.1，與鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品的m/z相同，并且3個菌株毒素提取物中的特異性物質(zhì)與鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖相同。結(jié)果證明，3株棉花枯萎病菌均可產(chǎn)生鐮刀菌酸。

2.5 3株棉花枯萎病菌毒素含量分析

3株棉花枯萎病菌具有相同的生長速率（結(jié)果未列出）。利用鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建了基于峰面積和鐮刀菌酸質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌酸質(zhì)量濃度在10～1 000 mg·L－1范圍內(nèi)與峰面積具有較高的線性關(guān)系（y＝16 635x＋51 237，R2＝0.999）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較了3個菌株毒素提取物中鐮刀菌酸的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，鐮刀菌酸的產(chǎn)量在3個菌株之間存在顯著性差異（表1）。棉花枯萎病菌7號生理小種毒素提取物中鐮刀菌酸的質(zhì)量濃度最大，為1 259.32 mg·L－1；ATCC96291毒素提取物中鐮刀菌酸的質(zhì)量濃度次之，為778.32 mg·L－1；而H70毒素提取物中鐮刀菌酸的質(zhì)量濃度最小，為135.18 mg·L－1。上述結(jié)果證明，7號生理小種產(chǎn)生的鐮刀菌酸最多，而H70產(chǎn)生的鐮刀菌酸最少。

2.6 3株棉花枯萎病菌毒素的毒力檢測

將質(zhì)量濃度為20 g·L－1的毒素采用葉片穿刺的方法接種于棉花葉片上，以20 g·L－1鐮刀菌酸為陽性對照，以甲醇和察氏培養(yǎng)基為陰性對照。結(jié)果顯示，鐮刀菌酸能引起棉花葉片發(fā)生大面積的萎蔫壞死，3個菌株的毒素提取液均能導(dǎo)致棉花葉片出現(xiàn)病斑，其中7號生理小種毒素提取液處理的病斑面積最大，其次是ATCC96291，而H70的毒素對棉花葉片的毒力最?。▓D7）。

2.7 棉花枯萎病菌在不同土壤中的致病力測定

對采自黃驊市、定興縣和成安縣的土壤進行理化性質(zhì)檢測，結(jié)果（表2）表明，黃驊市土壤堿性最強，有機質(zhì)含量較低；定興縣的土壤為輕壤土，有機質(zhì)含量較高；成安縣的土壤為褐土，土壤養(yǎng)分中等。

圖5 毒素提取液的高效液相色譜分析Fig.5 HPLC analysis of the toxins extracted from Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

圖6 鐮刀菌產(chǎn)生的毒素提取物中特異性物質(zhì)的質(zhì)譜分析Fig.6 Mass spectrum analysis of the specific com pound in toxin extracts of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

表1 鐮刀菌酸的產(chǎn)量比較Table 1 Production of the fusaric acid in the toxin extracts of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

利用感病品種冀棉11測定7號生理小種和菌株H70在不同地區(qū)土壤中的致病力，結(jié)果（圖8）表明，在3種不同類型土壤中，7號生理小種比H70的致病力更強。7號生理小種在定興縣和成安縣的土壤中致病力較強，病情指數(shù)分別為68.2和59.3，在黃驊偏堿性土壤中的致病力較弱，病情指數(shù)為34.6。H70在成安縣和定興縣土壤中的致病力較高，病情指數(shù)分別為32.0和29.3，在黃驊市土壤中的致病力較弱，病情指數(shù)為21.4。

3 討論

圖7 棉花枯萎病菌毒素致病力測定Fig.7 Pathogenicity ofthe toxin extracts from Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

表2 供試土壤理化性質(zhì)Table 2 Physical and chem ical properties of the tested soils

圖8 棉花枯萎病菌7號生理小種和新生理型菌株H70在不同土壤中的致病力Fig.8 Pathogenicity of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum race 7 and strain H70

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫?；鸵鸬拿藁ㄍ羵鞑『?。棉花枯萎病菌通過產(chǎn)生纖維素酶[19]和植物毒素[14]而引起棉花葉片萎蔫，植物生長緩慢，其中產(chǎn)生植物毒素是棉花枯萎病菌主要的致病機制。植物毒素會破壞植物細胞原生質(zhì)膜的透性，造成細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，植物吸水困難而呈現(xiàn)萎蔫[20]。另外，毒素還可以抑制植物防御反應(yīng)和呼吸活性，降低植物對逆境的抗性，從而導(dǎo)致植物生長緩慢甚至死亡[21-22]。澳大利亞生理型菌株和4號生理小種分別對澳大利亞和美國的棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，目前已經(jīng)明確鐮刀菌酸是澳大利亞生理型菌株和4號生理小種主要致病因子[23]。我國棉花枯萎病菌存在3號、7號、8號生理小種，最近研究發(fā)現(xiàn)我國存在不同于3號、7號和8號生理小種的新生理型菌株，命名為H70，該菌株與澳大利亞生理型菌株具有更加緊密的親緣關(guān)系[9]。本研究首先比較了7號小種、新生理型菌株H70和澳大利亞生理型菌株ATCC96291的培養(yǎng)性狀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PDB培養(yǎng)基中，7號小種可以產(chǎn)生淡褐色色素，而H70和ATCC96291菌株均不能產(chǎn)生色素。Bridge等研究發(fā)現(xiàn)，在含有七葉苷（Aesculin）的培養(yǎng)基中，2號、3號和4號枯萎病菌小種可以產(chǎn)生七葉素（Aesculetin），從而使培養(yǎng)基呈現(xiàn)深紅色，而1號小種和來自非洲的棉花枯萎病菌不能將七葉苷轉(zhuǎn)化為七葉素[24]。關(guān)于H70菌株和ATCC96291菌株是否可以將七葉苷轉(zhuǎn)化為七葉素需要進一步研究。尖孢鐮刀菌在無性階段產(chǎn)生多核的大型分生孢子和單核的小型分生孢子，其中大型分生孢子在其分類鑒定中具有重要意義[25]。本研究比較了7號小種、新生理型菌株H70和澳大利亞生理型菌ATCC96291產(chǎn)生分生孢子的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATCC96291菌株產(chǎn)生多核的大型分生孢子，7號小種產(chǎn)生多核和雙核的大型分生孢子，而新生理型菌株H70主要產(chǎn)生單核的小孢子。據(jù)此推測，分生孢子的形態(tài)可能是新生理型菌株的重要分類依據(jù)之一。為了明確新生理型菌株H70產(chǎn)生的毒素種類，本研究對棉花枯萎病菌該菌株、7號生理小種和澳大利亞生理型菌株ATCC96291的毒素提取物進行了液相色譜和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)3株棉花枯萎病菌產(chǎn)生的毒素具有一致的保留時間和相對分子質(zhì)量，通過與鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品進行比較，證明3株棉花枯萎病菌均產(chǎn)生毒素鐮刀菌酸。

棉花枯萎病菌不同生理小種產(chǎn)生的鐮刀菌酸產(chǎn)量不同，并且鐮刀菌酸的致病力與其產(chǎn)量正相關(guān)[26]。澳大利亞生理型菌株具有較強的致病力，對澳大利亞主要的栽培品種表現(xiàn)較強的致病力。研究發(fā)現(xiàn)，澳大利亞生理型菌株可以產(chǎn)生大量的鐮刀菌酸，并且致病力不同的菌株之間，鐮刀菌酸的含量有所差異，即鐮刀菌酸的產(chǎn)量與菌株的致病力相關(guān)[14]。本研究選用的7號生理小種表現(xiàn)強致病力，而新生理型菌株呈現(xiàn)弱致病力，澳大利亞標(biāo)準(zhǔn)菌株呈現(xiàn)中等致病力。為了明確不同菌株的致病力是否與其產(chǎn)生的鐮刀菌酸產(chǎn)量相關(guān)，本研究定量比較了3個菌株產(chǎn)生的鐮刀菌酸的產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7號生理小種的鐮刀菌酸產(chǎn)量最高，而新生理型菌株產(chǎn)生的鐮刀菌酸產(chǎn)量最低，不同菌株的致病力與其鐮刀菌酸產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關(guān)。本研究還采用葉片穿刺法檢測3株棉花枯萎病菌產(chǎn)生的毒素對棉花葉片的致病力，結(jié)果顯示其毒素均可以使棉花葉片出現(xiàn)病斑，7號生理小種的毒素造成的病斑面積最大，而新生理型菌株的毒素造成的病斑面積最小。該結(jié)果同樣證明鐮刀菌酸是棉花枯萎病菌主要的致病因子，其菌株的致病力強弱與其產(chǎn)生的鐮刀菌酸產(chǎn)量相關(guān)。

棉花枯萎病菌通過分泌植物毒素，不僅影響棉花的正常生長，而且抑制棉花根際其他有益微生物的生長，從而利于枯萎病菌在棉花根部的侵入和定植。而棉花根部存在大量的有益微生物，不僅可以抑制枯萎菌的生長，還可以降解植物毒素，緩解植物的中毒癥狀，從而發(fā)揮生物防治的效果[27]。尖孢鐮刀菌番茄?；停‵.oxysporumf.sp.lycopersici）通過分泌鐮刀菌酸而引起番茄萎蔫。Toyoda獲得1株能降解鐮刀菌酸的無致病性的青枯病菌（Pseudomonassolanacearum），該細菌處理番茄根際后能有效緩解尖孢鐮刀菌引起的番茄萎蔫癥狀[28]。棉花枯萎病菌4號生理小種可以產(chǎn)生大量的鐮刀菌酸，對美國大部分主栽棉花品種表現(xiàn)較強的致病力，給美國棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。研究發(fā)現(xiàn)，根際的真菌魯氏毛霉（Mucorrouxii）可以將鐮刀菌酸代謝為8-羥基鐮刀菌酸，后者對棉花的致病力較低。因此，棉花根部施用魯氏毛霉可以防治枯萎病。因此，明確了棉花枯萎病菌毒素種類，可以有目的地篩選降解毒素的微生物，用于創(chuàng)制新型微生物殺菌劑[12]。本研究明確了棉花枯萎病菌7號生理小種和新生理型菌株H70產(chǎn)生的植物毒素為鐮刀菌酸，可以篩選有效降解鐮刀菌酸的微生物，從而有針對性地開發(fā)防治棉花枯萎病的微生物殺菌劑。

本研究所用的新生理型菌株H70與澳大利亞生理型菌株ATCC96291具有較近的親緣關(guān)系。前期研究評價了新生理型菌株對海島棉匹馬90以及陸地棉冀棉11、冀棉169和中植棉2號的致病力，發(fā)現(xiàn)同7號生理小種相比，H70的致病力較弱[9]。澳大利亞菌株ATCC96291對澳大利亞所有的棉花品種均表現(xiàn)出較高的致病力，并且在偏堿性的土壤中致病力較強[8]。因此，本研究進一步評價了新生理型菌株H70和7號生理小種在不同土壤中的致病力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比7號生理小種，H70在3中不同類型土壤中的致病力均較弱；隨著土壤堿性的增強，7號生理小種和H70的致病力均降低，且后者較前者降低更緩慢，推測H70菌株較7號生理小種對堿性土壤的適應(yīng)能力可能更強。

4 結(jié)論

棉花枯萎病菌新生理型菌株H70不能形成淡褐色色素，形成的氣生菌絲較多，產(chǎn)生單核的小型分生孢子。H70、7號小種和澳大利亞生理型菌株ATCC96291均產(chǎn)生鐮刀菌酸，7號生理小種產(chǎn)生的鐮刀菌酸含量最高，而H70的鐮刀菌酸含量最低。鐮刀菌酸可以引起棉花葉片出現(xiàn)壞死癥狀，并且病斑大小與鐮刀菌酸的含量呈正相關(guān)性。新生理型菌株在3種不同類型土壤中的致病力均較低。