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    陸地棉纖維發(fā)育相關(guān)基因GhEXPs的分析及表達(dá)研究

    2021-06-19 08:39:36呂麗敏左東云王省芬張友平程海亮王巧連宋國(guó)立馬峙英
    棉花學(xué)報(bào) 2021年3期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域棉花

    呂麗敏,左東云,王省芬,張友平,程海亮,王巧連,宋國(guó)立,4*,馬峙英*

    (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北基地,河北 保定071001;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 安陽(yáng)455000;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001;4.鄭州大學(xué)/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州基地,鄭州450001)

    擴(kuò)展蛋白(Expansin)是一類重要的細(xì)胞壁蛋白,在酸性條件下它能松弛細(xì)胞壁,促使細(xì)胞增大[1-2]。擴(kuò)展蛋白在細(xì)菌、真菌和高等植物中以多基因家族的形式廣泛存在,在促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)、莖尖和根伸長(zhǎng)、葉片的形態(tài)建成、花和果實(shí)的發(fā)育、胚胎發(fā)生、花粉發(fā)育和花粉管生長(zhǎng)等過程中發(fā)揮著重要作用[3-6]。McQueen-Mason團(tuán)隊(duì)最早從黃瓜幼苗中分離出有活性的擴(kuò)展蛋白,研究表明該蛋白在酸性、離體條件下能夠促進(jìn)下胚軸細(xì)胞的伸長(zhǎng)[7]。

    近年來,隨著分子生物學(xué)的快速進(jìn)步和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家從植物和微生物中鑒定了多個(gè)物種的擴(kuò)展蛋白基因家族。通過對(duì)擬南芥[9]、大豆[10]、水稻[9]、大白菜[11]、楊樹[12]、煙草[13]等植物擴(kuò)展蛋白的研究發(fā)現(xiàn),植物類擴(kuò)展蛋白家族包括4個(gè)亞家族,分別為α-擴(kuò)展蛋白(EXPA)、β-擴(kuò)展蛋白(EXPB)、類α-擴(kuò)展蛋白(expansin-like A,EXLA)和類β-擴(kuò)展蛋白(expansin-like B,EXLB)[8]。該家族蛋白通常包含250~275個(gè)氨基酸殘基,氮端有包含20~30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,屬于分泌蛋白[3]。擴(kuò)展蛋白包括2個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域,分別是位于氮端的DPBB(Double-psi betabarrel)和碳端的CBM 63(Fam ily-63 carbohydrate binding module),其中DPBB是1個(gè)六鏈雙“ψ”β-桶形結(jié)構(gòu),CBM 63是碳水化合物結(jié)合模塊家族-63結(jié)構(gòu)域[4]。結(jié)構(gòu)分析表明,2個(gè)擴(kuò)展蛋白分子中間夾1個(gè)細(xì)胞壁多糖形成“三明治”式的結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)是擴(kuò)展蛋白促使細(xì)胞壁發(fā)生松弛的作用模型[3]。

    棉花纖維是胚珠表皮細(xì)胞分化伸長(zhǎng)的單細(xì)胞結(jié)構(gòu),它的特殊伸長(zhǎng)機(jī)制一直是生物學(xué)研究的熱點(diǎn),棉花纖維是研究單細(xì)胞伸長(zhǎng)的模式系統(tǒng)[14]。棉花纖維發(fā)育過程分為5個(gè)時(shí)期,分別是起始期、伸長(zhǎng)期、轉(zhuǎn)換期、次生壁合成期和成熟期,各個(gè)時(shí)期之間存在交互重疊,沒有嚴(yán)格的界限[15]。擴(kuò)展蛋白參與棉花纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)過程已取得了一些進(jìn)展[16-18],科學(xué)家利用棉花纖維的cDNA(Complementary DNA,互補(bǔ)DNA)文庫(kù)、基因芯片、SSH(Suppression subtractive hybridization,抑制差減雜交)文庫(kù)等技術(shù)從棉花中篩選出在纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因[19-20],發(fā)現(xiàn)EXPA亞家族的2個(gè)基因GhExp1和GhExp2在棉花纖維中高表達(dá)[21],后來證明這2個(gè)基因是位于棉花A亞組和D亞組的1對(duì)同源基因[22]。在陸地棉中過表達(dá)GhEXPA8基因能顯著促進(jìn)纖維的伸長(zhǎng)[23];序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)GhEXPA8和上述的GhExp2是同一個(gè)基因。通過對(duì)陸地棉擴(kuò)展蛋白全基因組分析,采用系統(tǒng)命名法將該基因命名為GhEXPA2,染色體定位分析發(fā)現(xiàn)它位于D亞組[22]。此外,從海島棉A亞組獲得了1個(gè)擴(kuò)展蛋白基因GbEXPATR,屬于EXPA亞家族,過表達(dá)該基因能夠使棉纖維變得更長(zhǎng)、更細(xì),強(qiáng)度更強(qiáng)。與陸地棉GhEXPA2相比,GbEXPATR缺少CBM 63結(jié)構(gòu)域,這可能與它在海島棉中的特殊功能有關(guān)[16]。近來,對(duì)陸地棉擴(kuò)展蛋白基因家族的研究鑒定了93個(gè)GhEXPs基因,發(fā)現(xiàn)一些基因在纖維發(fā)育中上調(diào)表達(dá)[22]。這些研究表明,擴(kuò)展蛋白在纖維發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

    早期科學(xué)家認(rèn)為擴(kuò)展蛋白通過減弱多糖和纖維素微纖絲之間的連接作用,從而使細(xì)胞壁松弛[2],也可能是通過清除纖維素和多糖之間的氫鍵使細(xì)胞壁松弛[8]。隨著研究的不斷深入,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁中的纖維素微纖絲呈束狀分層排列,并把纖維素微纖絲交叉的位置稱為“生物力學(xué)熱點(diǎn)(biomechanical hotspots)”,該區(qū)域存在的細(xì)胞壁多糖使纖維素微纖絲連接在一起[24]。目前,科學(xué)家已經(jīng)獲得了細(xì)菌擴(kuò)展蛋白 EXLX1(Expansin-Like X)和玉米EXPB亞家族的擴(kuò)展蛋白EXPB1(Zea m1)的晶體結(jié)構(gòu)。研究表明,芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是擴(kuò)展蛋白和多糖底物相互結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),并且十分保守[25-26]。擴(kuò)展蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析為我們深入了解其生物學(xué)功能和機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

    為進(jìn)一步闡釋棉花纖維伸長(zhǎng)的作用機(jī)制,解析擴(kuò)展蛋白在棉花纖維發(fā)育過程中發(fā)揮的作用。本文從陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選了4個(gè)在纖維發(fā)育過程中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因GhEX PA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a,對(duì)這4個(gè)GhEXPs基因的進(jìn)化關(guān)系、蛋白結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式等方面進(jìn)行了研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)材料陸地棉(Gossypium hirsutumL.)標(biāo)準(zhǔn)系TM-1是來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源中期庫(kù)的資源,本課題組種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院老所部試驗(yàn)基地(河南省安陽(yáng)縣,36°06′84.44″N,114°49′61.5″E)保存使用,田間常規(guī)管理。在盛花期對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行掛牌,分別于開花當(dāng)天(0 day post anthesis,0 DPA)、3 DPA、5 DPA、7 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和30 DPA的胚珠和纖維進(jìn)行取樣,5 DPA及之前時(shí)間點(diǎn)的樣品是胚珠和纖維未分離的材料,其余時(shí)間點(diǎn)的樣品均是從胚珠上剝離的纖維材料。冰上取材后立即放入液氮速凍,于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 總RNA的提取和c DNA制備

    RNA提取按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(貨號(hào):DP441,北京天根生化科技有限公司)說明書及參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行操作[22]。

    提取的RNA放置-80℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得的cDNA用超純水稀釋10倍后,-20℃冰箱保存,用于后面實(shí)驗(yàn)。步驟參考Takara公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨號(hào):6210A)的說明書及相關(guān)文獻(xiàn)[22]。

    1.2.2 棉花GhEXPs基因的克隆

    從棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cottonfgd.org/)[27]獲得4個(gè)GhEXPs的開放閱讀框,分別為Ghir_D05G018790.1(GhEXPA1d)、Ghir_A04G009030.1(GhEXPA4b)、Ghir_A05G038370.1(GhEXPA23b)和Ghir_A12G014930.1(Gh-EXPB3a)。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增每個(gè)基因的開放閱讀框(Open read frame,ORF),然后把序列連到pMDTM18-T載體上進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證?;蚩寺∷玫囊镄蛄幸姳?。

    表1 基因開放閱讀框擴(kuò)增的PCR引物Table 1 The primers for GhEXPs gene open read frame am plification

    1.2.3 棉花GhEXPs基因的進(jìn)化分析及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)建模

    利用MEGA 6.0軟件對(duì)4個(gè)GhEXPs蛋白以及其它物種的擴(kuò)展蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[28]。構(gòu)建進(jìn)化樹所用擬南芥蛋白序列來自擬南芥TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/),陸地棉擴(kuò)展蛋白序列來自相關(guān)報(bào)道[22],其他物種的擴(kuò)展蛋白序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),用4個(gè)GhEXPs蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST。選擇了包括單子葉、雙子葉植物以及擴(kuò)展蛋白不同亞家族成員,包括草莓:FaExp2(AF159563),歐洲甜櫻桃:PraExp1(AF297521)、PraExp2(AF297522),黃瓜:CsExp1(U30382)、CsExp2(U30460),番茄:LeExp1(U82123)、LeExp2(AF096776)、LeExp3(AF059487)、LeExp4(AF059488)、LeExp5(AF0-59489)、LeExp8(AF184232),水稻:OsExp1(Y07782)、OsExp4(U85246),獨(dú) 腳 金:SaExp3(AF291659),百日草:ZeExp3(AF230333),歐洲油菜:BnExp1(AJ000885),煙草:NtExp1(AF04-9350.1),豌豆:PsExp1(X85187),小麥:TaEXPA2(AAS48871.1),玉米:EXPB1_Zea m1(AAO45-608.1)。

    將4個(gè)GhEXPs蛋白序列去掉信號(hào)肽后,利用 在 線 軟 件 Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htm l/page.cgi?id=index)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)[29],然后利用軟件PyMOL V2.3.4對(duì)蛋白模型進(jìn)行可視化處理,再用Adobe Illustrator CS3 13.0.0編輯圖片標(biāo)注關(guān)鍵氨基酸信息。

    1.2.4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

    從0 DPA、3 DPA、5 DPA、7 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和30 DPA纖維和胚珠樣品中提取的總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。此外,從Cotton FGD(Cotton Functional Genom icsDatabase,https://cottonfgd.org/)[27]數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了其它組織樣品的RNA-Seq數(shù)據(jù),樣品包括:根、莖、葉、苞葉、花瓣、雄蕊、雌蕊和花托。測(cè)序結(jié)果的基因表達(dá)量用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)(Fragments per kilobase of m illion mapped reads,FPKM)表示。

    1.2.5 目的基因的表達(dá)分析

    通過qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,實(shí)時(shí)定量PCR)檢測(cè)0 DPA、3 DPA、5 DPA、7 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和30 DPA不同時(shí)期的棉花胚珠和纖維樣品中4個(gè)GhEXPs基因的表達(dá)情況。以UBQ7(GenBank登錄號(hào):AY189972)為內(nèi)參基因,引物見表2。試驗(yàn)所用試劑盒為Takara公司生產(chǎn)的TB GreenTMPrem ix Ex TaqTMII Kit(貨號(hào):RR820A),采用美國(guó)ABI的QuantStudioTM5熒光定量PCR儀。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[30]。利用Excel 2010進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 陸地棉4個(gè)GhEXPs基因的克隆及進(jìn)化分析

    本研究中4個(gè)GhEXPs基因(GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a)開放閱讀框分別為768 bp、795 bp、798 bp和804 bp。將GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和Gh-EXPB3a與棉屬及其他物種的擴(kuò)展蛋白一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1),發(fā)現(xiàn)GhEXPA4b、EXPA1d和GhEXPA23b分別屬于EXPA亞家族的第Ⅳ、Ⅴ和Ⅻ亞組,即EXPA-Ⅳ、EXPA-Ⅴ和EXPA-Ⅻ;GhEXPB3a屬于EXPB亞家族的第Ⅱ亞組,即EXPB-Ⅱ(圖1)。

    表2 定量PCR的引物Table 2 The primers for qRT-PCR

    2.2 陸地棉4個(gè)GhEXPs蛋白的三維建模及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

    目前植物中僅有玉米EXPB1和細(xì)菌中的EXLX1兩個(gè)擴(kuò)展蛋白解析了晶體結(jié)構(gòu),位于EXPB1和EXLX1三維結(jié)構(gòu)表面的芳香族氨基酸是它們和細(xì)胞壁多糖結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。為尋找棉花纖維細(xì)胞壁中擴(kuò)展蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),本研究把陸地棉的4個(gè)GhEXPs蛋白與上述2個(gè)蛋白進(jìn)行序列比對(duì)(圖2),鑒定關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在DPBB結(jié)構(gòu)域中,棉花4個(gè)擴(kuò)展蛋白GhEXPs與玉米EXPB1的色氨酸W 26和酪氨酸Y27對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)也是2個(gè)保守的芳香族氨基酸,其中GhEXPB3a與玉米EXPB1對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸完全相同,其余3個(gè)GhEXPs與W 26位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基為苯丙氨酸(F),4個(gè)Gh-EXPs與Y27對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)沒有發(fā)生變異。在CMB63結(jié)構(gòu)域中,玉米擴(kuò)展蛋白EXPB1的關(guān)鍵位點(diǎn)是Y 160和W 194,4個(gè)GhEXPs蛋白與Y160對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)變異為W或F(GhEXPA23b除外),與W 194對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)完全相同,沒有發(fā)生變異(圖2)。同時(shí),4個(gè)GhEXPs與微生物擴(kuò)展蛋白EXLX1也進(jìn)行了比對(duì),EXLX1中兩個(gè)連續(xù)的色氨酸W 125、W 126是該蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),4個(gè)GhEXPs與W 125、W 126對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)變異為YF(GhEXPA23b與W 126對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)除外)2個(gè)芳香族氨基酸(圖2)。

    圖1 4個(gè)GhEXPs蛋白與其它植物擴(kuò)展蛋白的聚類分析Fig.1 Phylogenetic tree of the four GhEXPs and other plant expansins

    利用在線軟件建立了陸地棉4個(gè)擴(kuò)展蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型,參考模型是玉米EXPB1(模板編號(hào):c2hczX)的結(jié)構(gòu),建模結(jié)果如圖3所示。GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和Gh-EXPB3a與玉米EXPB1的序列一致性分別為31%、34%、32%和42%,模型可信度均為100%。從三維結(jié)構(gòu)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果來看,GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a蛋白均包含DPBB和CBM 63兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,其中DPBB是典型的六鏈雙“ψ”β-桶結(jié)構(gòu),2個(gè)結(jié)構(gòu)域上分布有芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。我們把序列比對(duì)得到的關(guān)鍵芳香族氨基酸標(biāo)注在三維結(jié)構(gòu)圖中(圖3),在DPBB結(jié)構(gòu)域中,Gh-EXPA1d的F13、Y14,GhEXPA4b的F18、Y19,GhEXPA23b的F22、Y23和GhEXPB3a的W 19、Y20位于結(jié)構(gòu)的表面;而GhEXPA1d的W 183、F150,GhEXPA4b的W 187、F154,GhEXPA23b的W 190,Y155和GhEXPB3a的W 188、Y154位于CBM 63結(jié)構(gòu)域的表面(圖3)。

    圖2 4個(gè)GhEXPs與EXLX1和EXPB1的序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of 4 GhEXPs and EXLX1 and EXPB1

    從三維結(jié)構(gòu)圖可以看出,每個(gè)擴(kuò)展蛋白均有4個(gè)芳香族氨基酸分布在同一平面上,GhEXPA1d包括F13、Y14、F150和W 183,GhEXPA4b包括F18、Y19、F154和W 187,GhEXPA23b包括F22、Y23、W 190和Y155,GhEXPB3a包括W 19、Y20、W 154和W 188(圖3),但GhEXPA1d、Gh-EXPA4b和GhEXPB3a中與EXLX1的W 125對(duì)應(yīng)的芳香族氨基酸和它們并不在一個(gè)平面上(圖3)。而這些位于同一平面的保守氨基酸在細(xì)胞壁中與多糖結(jié)合可能是松弛細(xì)胞壁的關(guān)鍵。

    2.3 陸地棉中4個(gè)GhEXPs基因的組織表達(dá)分析

    根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析4個(gè)GhEXPs基因在棉花纖維發(fā)育不同時(shí)期及其他組織的表達(dá)情況(圖4)??傮w來看,GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a在胚珠和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá),在其他組織包括根、莖、葉、苞葉、花瓣、雄蕊、雌蕊和花托表達(dá)水平很低。其中GhEXPA1d和GhEXPA23b這兩個(gè)基因在纖維中特異表達(dá),在其他組織中基本不表達(dá);GhEXPA4b和Gh-EXPB3a在纖維之外的其它組織如葉片、雄蕊、雌蕊等有較低水平的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果初步分析表明,4個(gè)GhEXPs是在纖維發(fā)育中明顯優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因。

    圖3 陸地棉4個(gè)GhEXPs蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The predicted three-dimensional structures of 4 GhEXPs

    2.4 qRT-PCR分析驗(yàn)證4個(gè)GhEXPs基因的表達(dá)情況

    為進(jìn)一步驗(yàn)證4個(gè)陸地棉擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)情況,利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)4個(gè)GhEXPs基因的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。從圖5可以看出,4個(gè)GhEXPs基因在纖維發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄測(cè)序的結(jié)果基本一致(圖4和圖5)。GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a均在纖維發(fā)育的起始期和伸長(zhǎng)期上調(diào)表達(dá)。其中GhEXPA1d和GhEXPB3a在開花當(dāng)天(0 DPA)表達(dá)量相對(duì)較高,他們分別在開花后10 d和20 d的表達(dá)水平急劇下降(圖5);GhEXPA4b和Gh-EXPA23b在花后3~7 d表達(dá)量高,然后表達(dá)量開始下降(圖5)。此外,EXPA亞家族的3個(gè)基因在纖維中的表達(dá)情況也不相同,GhEXPA1d和GhEXPA4b的表達(dá)水平明顯高于GhEXPA23b。

    3 討論

    圖4 陸地棉4個(gè)GhEXPs基因在不同纖維樣品和組織中的轉(zhuǎn)錄組分析Fig.4 The transcriptome analysis of 4 GhEXPs from fiber and other tissues

    本研究鑒定了4個(gè)在棉花纖維中特異表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因,其中3個(gè)屬于EXPA亞家族,1個(gè)屬于EXPB亞家族,這與陸地棉擴(kuò)展蛋白基因EXPA亞家族占優(yōu)勢(shì)的結(jié)果一致[22]。蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確行使功能的基礎(chǔ)。在蛋白序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的DPBB結(jié)構(gòu)域上,對(duì)比棉花4個(gè)GhEXPs與玉米EXPB1、細(xì)菌EXLX1的關(guān)鍵保守位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),在這些關(guān)鍵位點(diǎn)也都是芳香族氨基酸,暗示了它們可能與玉米EXPB1和細(xì)菌EXLX1具有相似的功能,但個(gè)別氨基酸的差異,又凸顯了物種之間的不同。

    最近利用固態(tài)核磁共振(Solid-state nuclear magnetic resonance,ss-NMR)技術(shù)揭示了EXPB1蛋白結(jié)合的底物是半纖維素葡萄糖醛阿拉伯聚糖(GAX,glucuronoarabinoxylan)[31],點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)表明了EXLX1的結(jié)合底物主要是纖維六糖[3,32]。在本研究中,根據(jù)同源序列比對(duì)和建模分析,我們發(fā)現(xiàn)陸地棉4個(gè)GhEXPs與已報(bào)道的解析出晶體結(jié)構(gòu)的玉米擴(kuò)展蛋白EXPB1的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)基本相同,并與細(xì)菌中已經(jīng)解析結(jié)構(gòu)的EXLX1蛋白中在關(guān)鍵的芳香族氨基酸位點(diǎn)也有較高的一致性。由此推測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)的棉花擴(kuò)展蛋白可能具有類似的功能。另有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞壁纖維素在聚合粘連位置形成“生物力學(xué)熱點(diǎn)”,在這些位點(diǎn)起黏合作用的就是半纖維素成分,擴(kuò)展蛋白就是通過結(jié)合這些半纖維分子把它們從纖維素上解鎖從而松弛細(xì)胞壁的[24]。棉花纖維細(xì)胞壁的半纖維素成分有木葡聚糖、甘露聚糖和葡萄糖醛阿拉伯聚糖(GAX)等[15]。我們推測(cè)棉花擴(kuò)展蛋白也可能是通過與棉花纖維細(xì)胞中的半纖維成分結(jié)合而使細(xì)胞壁發(fā)生松弛,從而在內(nèi)部膨壓的驅(qū)動(dòng)下使纖維細(xì)胞不斷擴(kuò)展。然而,棉花擴(kuò)展蛋白在纖維細(xì)胞壁內(nèi)的生物機(jī)制以及具體結(jié)合的半纖維種類仍需要進(jìn)一步深入研究。

    圖5 陸地棉4個(gè)GhEXPs基因的qRT-PCR分析Fig.5 qRT-PCR analysis of 4 GhEXPs in upland cotton

    擴(kuò)展蛋白廣泛分布在植物和微生物的細(xì)胞壁中,通過松弛細(xì)胞壁促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)展[3,24,33]。研究表明,外加細(xì)胞壁蛋白的提取物能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)[7]。擬南芥根毛特異基因AtEXPA7的RNAi(RNA interference,RNA干擾)試驗(yàn)可明顯降低根毛細(xì)胞的長(zhǎng)度,與野生型對(duì)照相比,RNAi株系根毛長(zhǎng)度減少了25%~48%[6]。擴(kuò)展蛋白在參與棉花纖維發(fā)育也有諸多報(bào)道[16-18],GhEXPA1(即GhExp1[21])在開花后6~28 d的纖維中特異表達(dá)且是表達(dá)水平高的基因,Xu等[18]研究表明,GhEXPA1和GhRDL1相互作用共同調(diào)控纖維的伸長(zhǎng)。Li等[16]獲得海島棉擴(kuò)展蛋白基因GbEXPATR,過表達(dá)該基因能明顯促進(jìn)棉花纖維的伸長(zhǎng)。擴(kuò)展蛋白基因具有明顯的時(shí)空和組織表達(dá)特異性。在棉花纖維發(fā)育中已經(jīng)鑒定了位于A亞組和D亞組上的一對(duì)同源擴(kuò)展蛋白基因GhExp1和GhExp2[21],RNA印記實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明二者在纖維發(fā)育不同時(shí)期高表達(dá),而在根、莖、葉等組織中不表達(dá),超表達(dá)GhEXPA8(即GhExp2)基因可以明顯促進(jìn)棉纖維的伸長(zhǎng)[23,25]。本研究篩選獲得的陸地棉擴(kuò)展蛋白基因GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a也是在棉花纖維中特異表達(dá),在根、莖、葉等組織中表達(dá)量低(圖4),推測(cè)這些擴(kuò)展蛋白基因在促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)發(fā)育過程中也可能發(fā)揮著重要的作用。

    4 結(jié)論

    本文從陸地棉中獲得了4個(gè)在纖維中特異表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因,分別是GhEXPA1d、Gh-EXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a,前3個(gè)基因?qū)儆贓XPA亞家族,GhEXPB3a屬于EXPB亞家族。其編碼的蛋白均含有DBPP和CBM 63兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。三維結(jié)構(gòu)建模分析發(fā)現(xiàn),芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分布在擴(kuò)展蛋白2個(gè)結(jié)構(gòu)域表面的4個(gè)位點(diǎn),這些氨基酸處于同一平面上,可能是底物結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。4個(gè)基因在根、莖、葉、苞葉等組織中表達(dá)量低,在棉花纖維組織發(fā)育的前期優(yōu)勢(shì)表達(dá)。本研究為闡明擴(kuò)展蛋白基因?qū)w維發(fā)育的調(diào)控提供了理論依據(jù)。

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