秋季東北地區(qū)奶牛舍內(nèi)環(huán)境中微生物氣溶膠分布規(guī)律比較研究

李 晏，孫宏起，劉 明，李佃場(chǎng)，郭振東*，劉靜波*

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；4.青島市即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東青島 266200）

當(dāng)前我國集約化的高密度畜禽飼養(yǎng)模式使得畜禽舍內(nèi)氣溶膠濃度升高，環(huán)境中病原微生物濃度增加，給相關(guān)從業(yè)人員和動(dòng)物本身帶來健康風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。陳冠希等[4]研究表明，豬舍空氣顆粒物處理的小鼠肺部發(fā)生了明顯的病理性損傷和嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。劉傳德[5]研究發(fā)現(xiàn)，微生物氣溶膠的粒徑越小越易進(jìn)入動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)從而引發(fā)疾病。前人研究表明奶牛舍內(nèi)氣溶膠濃度隨季節(jié)變化而變化，且早晚存在一定的差異性[6]。奶牛舍內(nèi)微生物氣溶膠中總細(xì)菌濃度白天均高于夜晚，春季均高于夏季[7-8]。Wolinsky[9]研究表明，雞舍內(nèi)氣溶膠中氣載需氧菌含量增高能夠影響動(dòng)物免疫力，但奶牛舍內(nèi)氣載需氧菌含量增高對(duì)于奶牛免疫力的具體影響目前尚不明確。在空間上，由于通風(fēng)結(jié)構(gòu)及重力的影響，同一養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)不同位置、不同高度的氣溶膠濃度和微生物分布組成也可能存在一定的差異[10]。本研究通過在吉林地區(qū)一家奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛舍內(nèi)不同位置、不同高度開展秋季連續(xù)4 個(gè)月的監(jiān)測(cè)采樣，比較秋季奶牛舍內(nèi)氣溶膠顆粒濃度在同一位置不同高度的差異，分析秋季奶牛舍內(nèi)氣載需氧菌含量在同一位置不同時(shí)間的差異及分布規(guī)律，為進(jìn)一步評(píng)估奶牛飼養(yǎng)環(huán)境、減少疾病傳播提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)測(cè)奶牛舍基本情況 試驗(yàn)于吉林長春某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)選擇1 個(gè)成年奶牛舍，奶牛舍內(nèi)選取5 個(gè)采樣點(diǎn)（圖1）。奶牛舍為半封閉拴系式，舍內(nèi)基本無采暖措施，僅靠夜晚封閉牛舍保溫，采用雙坡屋頂結(jié)構(gòu)，舍內(nèi)采光為自然采光和人工照明相結(jié)合的方式，斜向風(fēng)扇通風(fēng)與自然通風(fēng)相結(jié)合，舍長80 m、寬10 m、高5 m（圖2）。舍內(nèi)飼養(yǎng)成年奶牛90 頭，奶牛自由采食，每天擠奶3 次，3 次投料、2 次整理臥床，清糞方式為鏟車清糞，每日1 次。在11 月和12 月，為實(shí)現(xiàn)保暖而在奶牛舍內(nèi)鋪設(shè)墊料，砂土作為臥床主要墊料。

圖1 奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)采樣點(diǎn)分布圖

圖2 奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)截面圖

1.2 奶牛舍空氣樣品采集方法 于2016 年9—12 月在奶牛舍內(nèi)5 個(gè)采樣點(diǎn)分別距地面 0.5、1.0、1.5 m 處采用激光粒子計(jì)數(shù)器（9306-V2 型號(hào)；提賽環(huán)科儀器貿(mào)易有限公司）監(jiān)測(cè)氣溶膠顆粒物粒徑大小和濃度，截取粒徑范圍分別為0.3～0.5、0.5～1.0、1.0～3.0、3.0～5.0、5.0～10 μm和＞10 μm；采用安德森6 級(jí)微生物氣溶膠采樣器采集空氣樣品進(jìn)行需氧菌含量測(cè)定，截取粒徑范圍如表1 所示。

表1 安德森6 級(jí)采樣器技術(shù)參數(shù)

1.3 氣溶膠顆粒物濃度測(cè)定 采用激光粒子計(jì)數(shù)器監(jiān)測(cè)奶牛舍內(nèi)不同采樣點(diǎn)及不同高度（0.5、1.0、1.5 m）處的氣溶膠粒徑分布及濃度，每個(gè)高度重復(fù)5 次，單次20 s，每次使用前將數(shù)據(jù)歸零重置，測(cè)得0.94 L 空氣中的氣溶膠顆粒物粒徑大小及數(shù)量。同時(shí)記錄奶牛舍環(huán)境衛(wèi)生情況，使用TSI 溫濕度風(fēng)速儀9545-A 測(cè)量采樣時(shí)的溫度、濕度、風(fēng)速。

1.4 氣溶膠中需氧菌數(shù)量測(cè)定 在2016 年9—12 月，使用哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基為安德森6 級(jí)采樣器（美國Tisch Environmental Inc 有限公司）中的采樣介質(zhì)，于每月10 號(hào)在奶牛舍內(nèi)采樣點(diǎn)距離地面1.0 m 處進(jìn)行樣品采集工作，確保周遭無工作人員活動(dòng)，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)采樣3 次，時(shí)間為3 min，空氣流量為28.3 L/min。將已吸附氣溶膠樣品的培養(yǎng)基，6 個(gè)一組做好標(biāo)記。將所有培養(yǎng)基統(tǒng)一收集起來，放入恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2 d后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量。通過ANDERSON 校正表進(jìn)行校正從而計(jì)算出氣載需氧菌菌落數(shù)量的校正總和。根據(jù)采樣器的采樣流量（28.3 L/min）和采樣時(shí)間計(jì)算出奶牛舍內(nèi)環(huán)境中氣載需氧菌濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 奶牛舍內(nèi)環(huán)境中的氣載需氧菌濃度按公式計(jì)算：

其中，C表示氣載需氧菌濃度（CFU/m3）；t表示采樣時(shí)間（min）；F表示采樣器的采樣流量（為28.3 L/min）；N1～N6為安德森六級(jí)采樣器上每層校正后的氣載需氧菌菌落數(shù)量。

當(dāng)微生物氣溶膠粒子粒徑小于5.0 μm 時(shí)，易進(jìn)入人體呼吸道，可計(jì)算吸入的氣載需氧菌濃度的百分比，計(jì)算公式：

其中，P表示可吸入氣載需氧菌濃度的百分比；N1～N6表示安德森六級(jí)采樣器上每層校正后的氣載需氧菌菌落數(shù)量。

使用SAS 軟件和Graphpad Prism 5.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋季奶牛舍內(nèi)氣溶膠顆粒物濃度分布規(guī)律 舍內(nèi)環(huán)境狀況如表2 所示。從圖3 可以看出，秋季奶牛舍內(nèi)氣溶膠顆粒物濃度與各采樣點(diǎn)距離地面高度（＜1.5 m）無直接關(guān)系。9 月奶牛舍內(nèi)點(diǎn)5 和點(diǎn)2 在距離地面0.5 m處的氣溶膠顆粒物濃度為最高和最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數(shù)量分別為1.96×105個(gè)和1.410 27×105個(gè)；10 月奶牛舍內(nèi)點(diǎn)2 和點(diǎn)5 在距離地面1.0 m 處氣溶膠顆粒物濃度最高和最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數(shù)量分別為1.31×105個(gè)和1.00×105個(gè)；11 月奶牛舍內(nèi)點(diǎn)4 在距離地面1.5 m 處氣溶膠顆粒物濃度最高，其點(diǎn)3 在距地面0.5 m 處的氣溶膠顆粒物濃度最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數(shù)量分別為2.53×105個(gè)和1.75×105個(gè)；12 月奶牛舍內(nèi)點(diǎn)4 在距地面1.0 m 處的氣溶膠顆粒物濃度最高，其點(diǎn)1 在距地面0.5 m 處的氣溶膠粒子濃度最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數(shù)量分別為2.65×105個(gè)和2.19 ×105個(gè)。同一個(gè)月內(nèi)其余各點(diǎn)之間氣溶膠顆粒物濃度差異不顯著。所以在9—12 月中奶牛舍內(nèi)氣溶膠粒子濃度與采樣點(diǎn)距離地面高度（＜1.5 m）無直接關(guān)系（配對(duì)樣品T 檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)（P＞0.05）。

表2 舍內(nèi)環(huán)境狀況

從圖4 可以得出，在不區(qū)分高度的情況下，4 個(gè)月中，10 月奶牛舍內(nèi)各點(diǎn)的氣溶膠粒子濃度最低，12 月時(shí)最高，相當(dāng)于10 月各點(diǎn)濃度的2 倍。從表2 中可得，12 月奶牛舍內(nèi)溫度和衛(wèi)生狀況較10 月大幅下降，濕度顯著上升，通風(fēng)條件變差。11 月與12 月間氣溶膠粒子濃度差異顯著，其余各月之間氣溶膠粒子濃度差異極顯著。從圖3-B 至3-D 中可以看出，10 月奶牛舍內(nèi)P5 處氣溶膠粒子濃度最低，12 月P3 處的氣溶膠粒子濃度最高。秋季奶牛舍氣溶膠粒子濃度隨時(shí)間變化，氣溫降低和濕度升高而升高。

圖3 秋季不同月份奶牛舍內(nèi)不同采樣點(diǎn)及采樣高度的氣溶膠顆粒物濃度

圖4 秋季不同月份氣溶膠粒子濃度

如圖5 所示，奶牛舍內(nèi)氣溶膠粒子濃度隨著粒子粒徑的增大而降低。選取奶牛舍內(nèi)氣溶膠粒子濃度差異最大的10 月與12 月進(jìn)行對(duì)比，兩者均在氣溶膠粒子粒徑為0.3～0.5 μm 時(shí)濃度最高，而在粒徑＞10.0 μm 的氣溶膠粒子濃度最低，兩者之間差異極顯著（圖5 和圖6）。當(dāng)粒徑在3.0～5.0 μm 和5.0～10.0 μm 時(shí)，10 月與12 月奶牛舍內(nèi)氣溶膠粒子濃度大致相等。

圖5 10 月與12 月不同粒徑范圍內(nèi)的氣溶膠粒子濃度趨勢(shì)

圖6 10 月不同粒徑的氣溶膠顆粒物濃度百分比

2.2 秋季奶牛舍內(nèi)氣溶膠中需氧菌豐度的影響 從圖7可以看出，奶牛舍內(nèi)氣溶膠中氣載需氧菌濃度隨月份增加呈先降低后升高的變化趨勢(shì)。在4 個(gè)月中，點(diǎn)1 處采集的氣溶膠中氣載需氧菌濃度明顯高于其他各點(diǎn)，9 月時(shí)最高為1.36×104CFU/m3，點(diǎn)3 處則明顯低于其他各點(diǎn)，10 月最低為0.84×104CFU/m3。從表3 中可以看出，在相同體積的空氣中，粒徑＜1 μm 時(shí)測(cè)得舍內(nèi)氣溶膠粒子數(shù)最高，粒徑＞10 μm 時(shí)氣溶膠粒子數(shù)最低。從圖8-A 可以看出，采集到的各組氣溶膠中氣載需氧菌菌落數(shù)量由高至低。氣載需氧菌菌落數(shù)量在總菌落數(shù)中占比最大為22.23%，位于第4 級(jí)，最小為7.38%，位于第6 級(jí)。

表3 采樣點(diǎn)1 處84.9 L 空氣中氣 溶膠粒子數(shù)與菌落數(shù)量

圖7 氣載需氧菌濃度隨月份變化趨勢(shì)圖

從圖8-B 可以看出，在可培養(yǎng)細(xì)菌中，生長于粒徑＜5.0 μm 的微生物氣溶膠上的細(xì)菌豐度明顯高于生長于粒徑＞5.0 μm 的細(xì)菌豐度。粒徑＜5.0 μm 的微生物氣溶膠更易隨空氣進(jìn)入呼吸道，在動(dòng)物和人身體的不同部位沉積。以每分鐘吸入微生物的CFU 表示，根據(jù)人的吸氣量（6.94×10-3m3/min），飼養(yǎng)人員在牛舍內(nèi)每小時(shí)可吸入2.45×103～3.60×103CFU 空氣細(xì)菌。

圖8 不同氣溶膠粒徑氣載需氧菌菌落數(shù)量百分比

3 討 論

本研究中隨月份改變，氣溫降低，奶牛舍內(nèi)環(huán)境濕度增加和衛(wèi)生狀況變差，氣溶膠粒子濃度升高，這與高玉紅等[11]的研究結(jié)果一致。本研究中奶牛舍內(nèi)氣溶膠粒子濃度差異最大的為10 月與12 月，12 月由秋季向冬季轉(zhuǎn)變，奶牛舍門窗關(guān)閉，封閉程度較高，奶牛舍內(nèi)墊料增加，10 月舍內(nèi)平均風(fēng)速為0.06 m/s，而12 月為0.02 m/s，通風(fēng)性能相對(duì)較差，從而引起舍內(nèi)氣載微生物數(shù)量和氣溶膠粒子濃度增加，這與單春花等[12]的研究結(jié)果相似。高玉紅等[13]研究顯示，不同建筑類型和不同時(shí)間段牛舍內(nèi)微生物數(shù)量均表現(xiàn)出顯著性差異；Islam 等[14]研究表明，奶牛舍內(nèi)外的溫度和氣流強(qiáng)度會(huì)影響微生物氣溶膠的傳播，Kristina 等[15]研究顯示，奶牛舍內(nèi)順風(fēng)處與逆風(fēng)處的空氣中真菌濃度差異顯著。本研究選取同一生長階段的奶牛，奶牛舍建造采用雙坡屋頂結(jié)構(gòu)，半封閉栓系式，較大程度限制了奶牛的活動(dòng)范圍，舍內(nèi)環(huán)境較為陰暗避光，機(jī)械通風(fēng)與自然通風(fēng)相結(jié)合，舍中央細(xì)菌濃度相對(duì)于4 個(gè)角落更高。本研究結(jié)果顯示，奶牛舍內(nèi)氣溶膠粒子濃度與距離地面高度（＞1.5 m）無直接關(guān)系，由于試驗(yàn)高度限制于當(dāng)時(shí)飼養(yǎng)環(huán)境高度和時(shí)間條件，此結(jié)論有待進(jìn)一步研究論證。單春花等[12]研究發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)散養(yǎng)式奶牛舍內(nèi)氣載需氧菌總數(shù)達(dá)到1 804～ 4 944 CFU/m3，與空氣中PM10 濃度之間存在顯著的線性正相關(guān)關(guān)系，而本研究結(jié)果顯示秋季奶牛舍內(nèi)氣溶膠中粒徑＞10.0 μm 的粒子濃度在10 月最低，12 月最高，舍內(nèi)氣載需氧菌濃度呈先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)檠芯克x擇的奶牛舍飼養(yǎng)條件不同，栓系式奶牛舍細(xì)菌密度一般顯著高于散養(yǎng)式奶牛舍[16]；而且取樣時(shí)間不同，本研究取樣時(shí)間跨度更小，奶牛舍內(nèi)氣溶膠顆粒粒徑范圍更廣，溫度變化更小。因此本研究發(fā)現(xiàn)奶牛舍氣溶膠菌落總數(shù)隨環(huán)境溫度的降低而下降，這與單春花等[12]研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示奶牛舍內(nèi)可吸入細(xì)菌豐度相較于非可吸入細(xì)菌差異極顯著，劉敬博等[17]使用培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測(cè)得奶牛舍內(nèi)氣載微生物（細(xì)菌和真菌）含量的平均值為2.09×105 CFU/m3，同時(shí)使用DAPI 染色計(jì)數(shù)法測(cè)得奶牛舍內(nèi)氣載微生物含量的平均值分別為8.36×106CFU/m3，2 種方法差異極顯著。本試驗(yàn)中僅使用安德森6 級(jí)微生物采樣器和培養(yǎng)基進(jìn)行可培養(yǎng)細(xì)菌的檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)得出氣載需氧菌的百分比含量，測(cè)得奶牛舍內(nèi)秋季氣載需氧菌含量最高為1.36×104CFU/m3，低于我國《畜禽場(chǎng)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 388-1999）所規(guī)定的牛舍氣載需氧菌含量2.0×104CFU/m3的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)低于段會(huì)勇等[18]檢測(cè)的牛舍中氣載需氧菌的濃度8.90×104～4.19×105CFU/m3，可能與所測(cè)動(dòng)物生長階段相關(guān)[19]，本研究未使用DAPI 染色計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物總含量，容易低估空氣中生物氣溶膠總量[20]。然而奶牛舍內(nèi)氣溶膠中的可吸入細(xì)菌容易造成多種呼吸道傳染病，同時(shí)可降低長期處于此環(huán)境中的技術(shù)人員和動(dòng)物的免疫力，對(duì)飼養(yǎng)人員生命健康有著嚴(yán)重威脅[21]。因此，在養(yǎng)殖過程中需重視對(duì)微生物氣溶膠濃度的監(jiān)測(cè)，未來應(yīng)建立完整的畜禽舍致病微生物采集和分析標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)投入對(duì)生物凈化劑和吸附劑的研究，促進(jìn)環(huán)境友好型生態(tài)養(yǎng)殖。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)奶牛舍內(nèi)的采樣點(diǎn)距離地面高度＜1.5 m 時(shí)，氣溶膠顆粒物濃度與高度無直接關(guān)系；秋季的4 個(gè)月中奶牛舍內(nèi)氣溶膠濃度變化趨勢(shì)相同；隨氣溫的降低和相對(duì)濕度的增加，氣溶膠粒子濃度增加；奶牛舍內(nèi)氣溶膠粒子濃度隨著粒子粒徑的增大而降低；秋季奶牛舍內(nèi)微生物氣溶膠中可吸入細(xì)菌豐度高于非可吸入細(xì)菌，奶牛舍內(nèi)氣載需氧菌濃度隨月份增加，舍內(nèi)溫度降低及墊料增加而呈先降低后上升的變化趨勢(shì)，環(huán)境因素對(duì)奶牛舍內(nèi)微生物氣溶膠濃度變化具有明顯影響。