精漿甘油三酯含量對(duì)豬精液保存效果的影響

甘麥鄰，劉 麟，鄭 婷，趙 雪，郭宗義，沈林園，潘紅梅，張 亮，王金勇*，朱 礪*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)的生豬飼養(yǎng)量和豬肉消費(fèi)量均是世界第一[1-2]。近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展和種豬聯(lián)合育種工作的需要，豬的人工授精技術(shù)快速發(fā)展和迅速普及[3]。此外，“非洲豬瘟”疫情仍在持續(xù)，豬精液的冷凍保存作為一種重要遺傳資源保存手段，可以對(duì)瀕危地方豬資源和優(yōu)秀公豬資源進(jìn)行有效保存[4]。在豬精液保存過(guò)程中，精子活率容易受到各種因素的影響[5]。精液中的脂類物質(zhì)主要來(lái)源于前列腺，正常情況下可作為精子能量的儲(chǔ)存庫(kù)[6]。甘油三酯（TG）是精液脂類中的重要成分之一[7]，在人類[8]和動(dòng)物生殖領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)TG 含量與精液量、精子活率和生殖道感染等指標(biāo)密切相關(guān)[9]。

豬精液由于脂質(zhì)含量和組分特征與其他哺乳動(dòng)物相差較大，導(dǎo)致其對(duì)低溫特別敏感，相關(guān)長(zhǎng)期保存技術(shù)仍不成熟[10]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究豬精液中TG 含量對(duì)豬精液常溫和冷凍保存的影響，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 12 頭3～5 歲大白公豬來(lái)自四川某公豬站，飼養(yǎng)管理一致，采精頻率每周2次。常溫稀釋液（AndroPRO Plus），冷凍基礎(chǔ)液（Androhep?CryoGuard Cooling &Freezing Extender）和解凍液（Androhep?CryoGuard Thaw Extender）（Minitube，德國(guó)）、新鮮雞蛋、甘油（索萊寶科技有限公司，北京）、0.25 mL 細(xì)管（IMV，法國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常溫保存 選取同一采精人員同一天采精的9 頭公豬，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)。采精后取中段精液經(jīng)紗布過(guò)濾后，在無(wú)菌、避光條件下使用專用精液稀釋液1:2 稀釋，置于17℃保溫箱保存。分別于保存0、24、48、96、144 h 檢測(cè)精子保存效果。

1.2.2 計(jì)算凍精總量 精子總數(shù)=精液密度×精液量。本研究擬設(shè)計(jì)冷凍精液密度為4 億/mL，因此凍精總量=總精子數(shù)÷4 億/mL，并以此計(jì)算后續(xù)冷凍稀釋液各組分的用量。

1.2.3 冷凍保存 將17℃恒溫保存過(guò)夜的稀釋精液，在預(yù)冷好的17℃離心機(jī)中2 300 ×g 離心5 min，棄上清；沉淀按8 億/mL 的濃度加入冷凍稀釋液Ⅰ（冷凍基礎(chǔ)液:新鮮蛋黃=4:1），吹勻后置于4℃平衡2.5 h；平衡結(jié)束后按1:1 比例加入冷凍稀釋液II（冷凍稀釋液I 加入終濃度6%的甘油，提前預(yù)冷到4℃），待加入II 液后45 min 左右開(kāi)始液氮熏蒸；精液細(xì)管在距液氮液面高度5 cm 左右（溫度-80～-120℃）熏蒸8 min 后投入液氮，冷凍精液細(xì)管分別裝入標(biāo)記好的拇指管和布袋中置于液氮罐保存?zhèn)溆?；解凍時(shí)從液氮中取出細(xì)管，以42℃水浴16 s 的解凍方式進(jìn)行解凍，然后以1:9 加入解凍液，37℃孵育10 min 檢測(cè)活率。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 取中段精液稀釋前的原精，在17℃環(huán)境3 000 ×g 離心5 min，取精漿，檢測(cè)TG、過(guò)氧化氫（H2O2）、總抗氧化能力（T-Aoc）、果糖（Fructose）、鋅（Zn）、總蛋白（TP）、總氨基酸（TAA）、白蛋白（ALB）含量和酸性磷酸酶（ACP）活性，檢測(cè)試劑盒均使用索萊寶公司（北京）生產(chǎn)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 精液質(zhì)量檢測(cè) 將豬專用精子計(jì)數(shù)板置于37℃載物臺(tái)預(yù)熱，再將精液樣品緩慢注入計(jì)數(shù)待檢計(jì)數(shù)室，使之均勻流入整個(gè)計(jì)數(shù)室，再在顯微鏡下觀察并使用精子自動(dòng)分析系統(tǒng)（AndroVision，Minitube，德國(guó)）分析精子活率、活力、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)和慢速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)。常溫保存時(shí)間從稀釋穩(wěn)定后開(kāi)始算起；冷凍保存時(shí)間從完成冷凍操作后投入液氮中開(kāi)始算起。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 精子計(jì)數(shù)和分析系統(tǒng)使用AndroVision。所有結(jié)果均表示為“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差”。運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)采用T 檢驗(yàn)方法。P＜0.05 時(shí)記為顯著，P＜0.1時(shí)記為存在趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 不同保存方法對(duì)豬精子活率、活力和運(yùn)動(dòng)指標(biāo)的影響 如圖1 所示，常溫稀釋的精液在17℃恒溫保存，精子活率、活力、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子均隨時(shí)間推移而下降，至144 h 時(shí)精子活率、活力和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例均低于0 h（P＜0.05），但144 h時(shí)仍有66.6%的活率和50.22%的活力，依舊維持在較高水平。而冷凍保存精子在42℃，16 s 條件下解凍后活率為45.46%，活力為34.99%，低于常溫保存的各個(gè)時(shí)間段組（P＜0.05）。

圖1 豬精液不同保存方式精子指標(biāo)變化

2.2 精漿TG 含量與豬精液保存指標(biāo)的相關(guān)性分析 本研究中豬精漿TG 含量平均值為（0.66±0.30）mmol/L（最小值0.23 mmol/L，最大值1.00 mmol/L）。從表1可以看出，精漿中TG 含量與稀釋保存0 h 和144 h 后的精子活率、活力、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子均不相關(guān)（P＞0.05），但精漿中TG 含量與豬精液冷凍保存后的活率顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），精漿TG 含量與冷凍保存后的精子活力、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子存在負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)（P＜0.1）。

表1 精液TG 含量與豬精子指標(biāo)的相關(guān)性分析 %

2.3 精漿中高、低TG 的生化指標(biāo)分析 為進(jìn)一步分析精漿TG 水平對(duì)豬精液保存效果的影響，選取相近日齡的大白公豬6 頭，其中精漿高TG 和低TG 公豬各3 頭（圖2-A），兩組的TG 含量相差3.18 倍，在同一天采集精液，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高TG 組精漿中果糖、H2O2、TP 含量顯著或極顯著高于低TG 組，ALB 也存在相同趨勢(shì)（P＜0.1），其余生化指標(biāo)無(wú)顯著差異。

圖2 豬精漿不同TG 含量對(duì)精漿生化指標(biāo)的影響

2.4 精漿高TG 組和低TG 組不同保存方式下精子指標(biāo)差異 如圖3 所示，精液稀釋并在17℃恒溫箱中緩慢降溫至17℃穩(wěn)定后立即檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)精漿高TG 組的精子活力高于低TG 組（P＜0.05），精子活率、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子均無(wú)顯著差異。17℃保存144 h 后，高TG 組與低TG 組各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異。液氮冷凍保存后，高TG 組精子活力和快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子與低TG 組無(wú)顯著差異，但高TG 組精子活率低于低TG 組（P＜0.05），且慢速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)與低TG 組相比有降低趨勢(shì)（P＜0.1）。

圖3 豬精漿不同TG 含量對(duì)不同保存方式精子指標(biāo)的影響

精漿高TG 組和低TG 組精液在常溫保存0 h 和144 h 及冷凍-解凍后測(cè)得H2O2含量均無(wú)顯著差異，但常溫保存144 h 與0 h 相比，精漿高TG 組精液H2O2含量上升4.50 倍，而精漿低TG 組精液H2O2含量?jī)H較0 h上升2.37 倍。

冷凍-解凍精液檢測(cè)結(jié)果表明，高TG 組精子活率、活力下降均超過(guò)50%，高于低TG 組（P＜0.01）。兩組間快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子下降比率未達(dá)顯著水平。

3 討 論

3.1 精漿TG 含量對(duì)豬精液常溫保存的影響 豬精液常溫保存技術(shù)目前應(yīng)用較為普及[11]，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中被大面積推廣使用，大多數(shù)常溫保存技術(shù)可以有效保存3～5 d[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，常溫保存3～5 d 對(duì)精子活率和活力無(wú)顯著影響，在保存144 h（7 d）后精子活率和活力才顯著下降。

動(dòng)物精子與精囊腺、前列腺和附睪的分泌物共同構(gòu)成精液。精漿中的脂類主要來(lái)源于前列腺，其功能是作為精子的能量物質(zhì)。在人醫(yī)臨床檢測(cè)中，TG 含量的高低常被用于輔助鑒別前列腺異常[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，精漿中TG 含量與稀釋保存0 h 和144 h 后的精子活率、活力、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子均不相關(guān)。精漿果糖是精囊腺功能的特征性標(biāo)記物，也是精子能量代謝的重要來(lái)源，經(jīng)糖酵解和線粒體呼吸作用產(chǎn)生的ATP 為精子供能[14]。精液中活性氧（ROS）作為生理過(guò)程中信號(hào)傳導(dǎo)元素，在精子獲能中起重要作用，適量的ROS 是調(diào)節(jié)正常精子功能（如精子獲能、精卵融合等）所必需的，起到介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)磷酸化等重要生理生化功能[15]，但過(guò)量的ROS 會(huì)引起精子質(zhì)膜、DNA 損傷，導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，H2O2是精液中ROS 的重要組成成分[16]。研究發(fā)現(xiàn)，精漿蛋白與男性生育力息息相關(guān)，它可以影響精子的成熟、獲能、受精并反映前列腺、精囊腺的功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高TG 組精漿中果糖、H2O2、TP 含量顯著高于低TG 組，且高TG 組原精中精子活力顯著高于低TG 組，可能是高TG 組精液的果糖和蛋白等能量物質(zhì)較豐富，而短時(shí)間內(nèi)H2O2未對(duì)精子造成損傷。

圖4 豬精漿不同TG 含量對(duì)不同保存方式精液H2O2 含量的影響

圖5 豬精液冷凍保存后精子指標(biāo)下降比率

在常溫（17℃）保存豬精液時(shí)通常不會(huì)去除精漿[18]，此外，常規(guī)離心并不能完全去除精漿，且副性腺分泌物在體內(nèi)對(duì)精子已經(jīng)產(chǎn)生了影響，豬精液保存過(guò)程中精漿分泌物對(duì)精子的作用還會(huì)產(chǎn)生持續(xù)影響。精漿中的脂類物質(zhì)在保存過(guò)程中會(huì)發(fā)生氧化，而精漿中的過(guò)氧化氫也會(huì)進(jìn)一步加劇氧化過(guò)程，產(chǎn)生大量ROS[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在精漿中高TG 組精子活力顯著高于低TG 組，且精子活率、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子均略高于低TG 組。但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各項(xiàng)精子指標(biāo)變化不大，僅精子活率和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)略低于低TG 組。此外，17℃保存144 h 后檢測(cè)結(jié)果表明，高TG 組精液H2O2含量較保存0 h 上升4.50 倍，而低TG組精液H2O2含量?jī)H上升2.37 倍?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著常溫保存時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，高TG 組精液質(zhì)量下降的速度高于低TG 組。

3.2 精漿TG 含量對(duì)豬精液冷凍保存的影響 由于豬精液中精子密度較低，且豬精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和組分特征與其他哺乳動(dòng)物存在較大差異[20]。長(zhǎng)期以來(lái)，豬精液的冷凍保存和推廣使用一直未取得突破性進(jìn)展。精液中的副性腺分泌物通常能為精子提供能量和保護(hù)，但這些精漿組分是否會(huì)對(duì)精液冷凍后的精子質(zhì)量造成影響還知之甚少。

豬精液冷凍保存和復(fù)蘇，經(jīng)歷了從液態(tài)—固態(tài)—液態(tài)的變化，因此初始的精子損害會(huì)被進(jìn)一步放大[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，精漿TG 含量與精液冷凍復(fù)蘇后的精子活率呈顯著負(fù)相關(guān)。盡管新鮮精液中高TG 組具有更高的活力，但凍存后其活力顯著下降，慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)也有下降趨勢(shì)，且高TG 組精液凍存后的精子活率和活力下降比例也顯著高于低TG 組。由于豬精液冷凍保存會(huì)以離心方式去除精漿，一方面在離心之前精漿脂質(zhì)已經(jīng)對(duì)精子造成損害，另一方面精子表面可能附著了脂質(zhì)成分，對(duì)保存過(guò)程的精子造成了持續(xù)傷害。

精漿成分主要是副性腺的分泌物，而這些分泌過(guò)程受生理、營(yíng)養(yǎng)和管理等因素的影響，因此可通過(guò)相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)和管理手段達(dá)到適當(dāng)調(diào)節(jié)的目的[22]。由于常溫保存和冷凍保存均與豬直接交配的生理過(guò)程和環(huán)境不同，因此推測(cè)常溫短期保存可不必考慮精漿TG 水平，而常溫長(zhǎng)期保存和冷凍保存應(yīng)在優(yōu)先考慮新鮮精液質(zhì)量的基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)精漿TG 含量，選擇低TG 水平的精液用于保存。目前，關(guān)于影響豬精漿TG 含量的環(huán)境和遺傳因素的研究報(bào)道均比較缺乏，還有待于進(jìn)一步探究。在后續(xù)研究中可通過(guò)干預(yù)影響豬精漿TG 含量的因素，進(jìn)一步調(diào)控豬精漿TG 水平，以利于豬精液的長(zhǎng)期保存。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，精漿TG 水平對(duì)豬精液冷凍保存存在不利影響，而對(duì)常溫保存精液影響較小。在豬精液的常溫保存過(guò)程中可以不必考慮精漿TG 水平，而冷凍保存時(shí)選擇精子活力和活率高且TG 含量較低的精液可以取得更好的保存效果。豬精漿TG 水平可以作為一個(gè)預(yù)估豬精液冷凍價(jià)值的潛在指標(biāo)，但其作用機(jī)制和內(nèi)在規(guī)律還有待于在大樣本和分子及超微結(jié)構(gòu)層次做更深入研究。