從江香豬CAST 基因的組織時序表達規(guī)律分析

張富林，楊 洋，楊啟會，孔德順

（1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550025；3.貴陽市烏當區(qū)新堡鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務中心，貴州貴陽 550025）

CAST 首次在1964 年被正式認定為鈣蛋白酶系統(tǒng)的成員[1]，并于1979 年被命名為鈣蛋白酶抑制酶[2]，主要在細胞信號傳導、肌肉生長等過程中發(fā)揮功能作用。CAST 是一種內源性抑制蛋白，主要作用方式為該蛋白可以通過與被Ca2+激活的鈣蛋白酶的特異性結合從而抑制蛋白酶的活性[3]。CAST 對肉質的嫩度和風味有著重要影響，通過對鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白活性的調節(jié)可實現(xiàn)對畜禽肌肉生長發(fā)育的調控，在畜禽肌肉組織中，鈣蛋白酶系統(tǒng)控制著肌纖維蛋白的降解，在肌肉蛋白質降解的過程中起到限速的作用，尤其在宰后肌肉嫩度變化中起著關鍵作用[4]。目前，挖掘肉質性狀調控基因或肉質性狀連鎖遺傳標記是改良肉用家畜的有效途徑[5]，CAST基因在家畜上的研究主要集中在該基因多態(tài)性與肉質性狀的關聯(lián)性上[6]。劉香等[7]通過對72 頭蘇太豬CAST基因的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在CAST基因的第6 內含子上MspI 酶切位點的3 種基因型間在肌肉的嫩度、pH 值、系水力水平指標上均差異顯著。王華[6]等通過對5 個綿羊品種CAST基因多態(tài)性及其與肉品質的相關性分析，發(fā)現(xiàn)CAST基因可作為綿羊產(chǎn)肉性能和肉品質的分子標記輔助。以上研究結果表明CAST基因對家畜肉質性狀具有一定的影響，從江香豬作為貴州優(yōu)質的地方資源品種，具備體型矮小、肉質香嫩、基因純合、純凈無污染等特點，對于CAST基因在從江香豬組織中的時序表達未見報道，本實驗以貴州從江香豬為研究對象，采用熒光定量PCR 技術對從江香豬不同月齡組織中CAST基因的表達進行檢測分析，以期為進一步研究CAST基因對從江香豬肉質性狀的調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣本采集 采集1、3、6、9、12 月齡從江香豬的心肌、肝臟、骨骼肌、背最長肌和脂肪5 個組織樣本，置于液氮中保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol 試劑、氯仿、異丙醇購自莫納生物科技有限公司（珠海）；逆轉錄試劑盒購自百樂科技有限公司；實時熒光定量試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺購自全凈凈化科技有限公司；實時熒光定量PCR 儀購自廣州安邦生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司；PCR儀購自中康中衛(wèi)（上海）生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織總RNA 的提取及逆轉錄 采用TRIzol 法提取樣本總RNA，總RNA 提取完成后，使用紫外分光光度計對其濃度和純度進行檢測，檢測完成后使用ddH2O 將其濃度稀釋到同一水平后備用。使用逆轉錄試劑盒將提取的RNA 進行逆轉錄，逆轉錄反應體系20 μL：提取的RNA 模板1.5 μL、Primer Mix 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、Ribo Lock RNase Inhibitor 1 μL、Revert Aid M-Mu LV RT 1 μL、無酶水9.5 μL。逆轉錄條件設置為65℃變性5 min，42℃孵育60 min，70℃失活反應5 min。

1.2.2 引物設計與合成 根據(jù)NCBI 上豬CAST基因的mRNA 序列（登錄號：NM_214067.1），通過Primer 5.0軟件進行引物設計，并交由上海英俊生物技術有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 CAST 基因引物信息

1.2.3CAST基因的克隆與檢測 以從江香豬背最長肌cDNA 為模板進行CAST基因的克隆?？寺◇w系20 μL：上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 模板（20 ng/μL）1 μL、DNA 聚合酶10.0 μL、ddH2O 7 μL。反應條件為95℃預變性4 min，95℃變性35 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 反應結束后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將產(chǎn)物進行測序。

1.2.4 實時熒光定量PCR 將1.2.1 中獲得的cDNA 進行實時熒光定量PCR 反應，反應體系10 μL：SsoFast EvaGreen Supermix 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 模 板（100 ng/μL）2 μL，ddH2O 2 μL。實時熒光定量PCR 反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，59.5℃退火30 s，循環(huán)40 次后進行熔解曲線分析，以每5 s 上升0.5℃的速率從65℃升高到95℃。熒光信號在每個循環(huán)結束時檢測，每個樣品做3 個重復。

1.3 統(tǒng)計分析 采用2-??Ct方法對qRT-PCR 結果進行分析，利用SPSS 18.0 軟件對實驗獲得的實時熒光定量PCR 結果進行單因素方差分析，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1CAST基因CDS 區(qū)的克隆 將擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖電泳鑒定，結果顯示條帶單一，并且與預期大小一致（圖1）。

圖1 CAST 基因PCR 擴增電泳圖

2.2 從江香豬不同時間段相同組織CAST基因表達分析 經(jīng)測序比對，克隆的CAST基因擴增結果與設計合成序列一致，且CAST基因內參GAPDH基因的擴增曲線均呈現(xiàn)S 型，拐點清晰，并且熔解曲線均只有一個峰，說明熒光引物特異性較好，實驗結果可靠（圖2）。由圖3 可知，在心臟組織中，CAST基因的表達量由高到低依次為6、12、9、3、1 月齡（P＜0.01）。在肝臟組織中，CAST基因的整體表達趨勢呈現(xiàn)先增高再減少，且在3、6 月齡的表達量極顯著高于1、9、12 月齡。在骨骼肌中，CAST基因在9 月齡的表達量最高（P＜0.01），12 月齡表達量極顯著高于6、3、1 月齡，1 月齡和3 月齡表達量無顯著性差異。在背最長肌中，CAST基因在9 月齡表達量最高（P＜0.01），6 月齡表達量極顯著高于12、1、6 月齡，1 月齡和6 月齡表達量無顯著性差異。在脂肪中，CAST基因在9 月齡表達量最高（P＜0.01），其次由高到低依次為6 月齡、12 月齡、3 月齡、1 月齡，1 月齡極顯著低于其他月齡。

圖2 CAST 基因和GAPDH 基因的擴增曲線及熔解曲線

圖3 CAST 基因在相同組織中不同月齡之間的表達量差異

2.3 從江香豬相同月齡不同組織中CAST基因的表達分析 相同月齡不同組織中實時熒光定量PCR 結果如圖4 所示，在不同月齡的心臟、肝臟、骨骼肌、背最長肌和脂肪中CAST基因均有表達，說明該基因在從江香豬各組織表達具有廣譜性。1 月齡時，CAST基因在背最長肌中的表達量最高，極顯著高于其他組織，肝臟中表達量最低。3 月齡時，CAST基因在心臟中的表達量最高（P＜0.01），背最長肌中的表達量與骨骼肌無顯著差異，但兩者表達量均極顯著高于脂肪和肝臟組織，在肝臟中表達量最低。6 月齡時，CAST基因表達由高到低為心臟＞骨骼?。颈匙铋L肌＞脂肪＞肝臟（P＜0.01）。9 月齡時，CAST基因表達量為骨骼?。颈匙铋L?。拘呐K＞脂肪＞肝臟（P＜0.01）。12 月齡時，CAST基因表達量為骨骼?。拘呐K＞背最長?。局荆靖闻K（P＜0.01）。

圖4 CAST 基因在相同月齡不同組織中的表達差異

3 討 論

CAST基因作為一種鈣蛋白酶依賴的特異性抑制劑，廣泛存在于動物體內，有研究顯示通過對鈣蛋白酶-鈣蛋白酶抑素系統(tǒng)的活性改變可以調控肉的嫩度[8]。本實驗結果顯示，CAST基因的mRNA 在從江香豬心臟、肝臟、骨骼肌、背最長肌和脂肪5 個組織的不同時間段均有表達，這一結果與CAST基因在其他哺乳類及禽類動物中的研究結果相符[9-12]，說明CAST基因在家禽及家畜不同組織中的表達均具有廣譜性，也進一步證實了鈣蛋白酶抑制酶在豬細胞中是普遍存在的。本研究結果顯示在幼齡從江香豬各組織中CAST基因的表達量均不高，但均有表達，這一結果與李武峰[13]等對廣靈驢組織中CAST基因的表達研究一致；隨著年齡的增長，在從江香豬不同年齡段CAST基因在脂肪中的表達量始終相對較低，而在心臟、骨骼肌、背最長肌中的表達量顯著增加。管凇等[13]研究顯示與幼齡階段黑山羊相比CAST基因在成年后的黑山羊心肌、肝臟、骨骼肌中的表達量顯著增加，但在脂肪中的表達量始終相對較低，這與本研究結果基本一致，說明CAST基因可能在調控肌肉的剪切力及嫩度方面具有一定作用，同時也揭示了CAST基因可能會對從江香豬肌肉剪切力和嫩度存在調控作用。本實驗對從江香豬不同月齡各組織間表達量進行比較分析發(fā)現(xiàn)，心臟、骨骼肌和背最長肌為CAST基因的優(yōu)勢表達組織，這與肖蘞[10]在山地烏骨雞中對CAST基因的研究結果一致。本研究顯示在從江香豬3 月齡和6 月齡，CAST基因在各組織中的表達總趨勢為心臟＞骨骼肌＞背最長?。局荆靖闻K，且各組織間表達差異極顯著，這與劉安芳[14]報道的CAST基因在艾維茵祖代肉種雞、寶萬斯尼拉祖代蛋用種雞以及四川大恒家禽育種公司培育的并經(jīng)過四川省品種委員會審定通過的優(yōu)質雞純AB、D 系祖代種雞等品種中的肌肉組織中表達量顯著高于其他組織的結果存在差異，可能是實驗品種及所測定樣品的月齡不同等導致；而在其余時間段顯示CAST基因在骨骼肌及背最長肌中的表達量較高，這一結果與劉安芳[14]研究結果相似。Ciobanu 等[15]發(fā)現(xiàn)豬CAST基因與系水力、嫩度、蒸煮損失等肉質性狀顯著相關，對豬肉的pH 影響較小。綜上可知，CAST基因可能是影響從江香豬肌肉剪切力和嫩度的主效控制基因。

4 結 論

結果表明，CAST基因在不同月齡段不同組織中均有表達，說明CAST 基因表達具有廣譜性，且在不同月齡段不同組織中表達量具有差異性，證實CAST 基因可能是影響從江香豬肌肉剪切力和嫩度的主效控制基因。