植物miR156及靶基因SPL家族的研究進(jìn)展

韓佳婷，馮光燕，帥 楊，焦永娟，張新全

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院，四川成都611130）

開(kāi)花是大多數(shù)高等植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵點(diǎn)，是植物繁衍后代的重要階段[1]。開(kāi)花過(guò)程受復(fù)雜的外部環(huán)境刺激和內(nèi)在基因調(diào)控的共同作用，其中相關(guān)基因的表達(dá)是實(shí)現(xiàn)開(kāi)花的主要誘導(dǎo)因素之一[2-3]。金魚(yú)草(Antirrhinum majus)花分生組織特征基因SQUAMOSA(SQUA)與擬南芥(Arabidopsis thaliana)的花分生組織特征基因AP1(APETALA1)同源，均為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是最早發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)控植物開(kāi)花功能的基因之一[3-6]。1992年，Klein等[4]將SQUA基因作為研究花形成過(guò)程分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的起點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)金魚(yú)草SQUA突變體株系的苞片過(guò)多、花畸形或不完整，認(rèn)為SQUA具有控制花形態(tài)發(fā)生的作用。Huijser等[5]發(fā)現(xiàn)金魚(yú)草中的兩個(gè)成員(SBP1和SBP2)可以與SQUA基因啟動(dòng)子相互作用，并通過(guò)影響SQUA的表達(dá)參與花的早期發(fā)育調(diào)控。隨后在擬南芥、水稻(Oryza sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)等多個(gè)物種中均鑒定到SPL家族(即SBP家族)的存在，發(fā)現(xiàn)其具有改變?nèi)~片形狀、調(diào)控分蘗或分枝、參與果實(shí)形態(tài)建成及成熟過(guò)程等作用[7-9]。而眾多的研究表明，SPL家族能被miR156負(fù)調(diào)控從而影響植物開(kāi)花。

MiR156最先發(fā)現(xiàn)于擬南芥[10]，由約20個(gè)核苷酸組成，結(jié)構(gòu)保守，通過(guò)靶向SPL家族參與植物表型改變和開(kāi)花調(diào)控過(guò)程[7,11]。SPL家族中部分成員3'UTR區(qū)和CDS區(qū)包含miR156識(shí)別位點(diǎn)，且不同物種受miR156調(diào)控的SPL數(shù)量存在差異(表1)。MiR156識(shí)別SPL后可以通過(guò)剪切降解方式抑制SPL的表達(dá)[17]。研究者[9,18]分別通過(guò)在番茄中對(duì)miR156進(jìn)行過(guò)表達(dá)和煙草(Nicotiana tabacum)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)化證明了miR156對(duì)SPL13的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。將擬南芥SPL3中miR156識(shí)別位點(diǎn)突變后，轉(zhuǎn)基因植株中檢測(cè)到SPL3蛋白；而正常過(guò)表達(dá)SPL3時(shí)，雖然其轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，但并未檢測(cè)到SPL3蛋白的存在，說(shuō)明miR156還可以通過(guò)抑制翻譯的方式負(fù)調(diào)控SPL的表達(dá)水平[19]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR156-SPL互作具有調(diào)控植物開(kāi)花、改變植物相關(guān)表型特征、提高籽粒產(chǎn)量、響應(yīng)生物和非生物脅迫等多種生物學(xué)功能，且這些功能的研究多集中于模式植物擬南芥和水稻中[7,15,20-21]。本研究重點(diǎn)闡述miR156-SPL模塊調(diào)控植物開(kāi)花、株型結(jié)構(gòu)、果實(shí)發(fā)育、脅迫響應(yīng)的作用及其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合草類(lèi)植物miR156-SPL的研究進(jìn)展，為分子育種提供理論依據(jù)。

表1 不同物種SPL家族成員數(shù)量Table 1 Number of SPL family members in different species

1 MiR1 5 6 -SPL調(diào)控植物開(kāi)花

開(kāi)花植物的成花過(guò)程包括開(kāi)花誘導(dǎo)、花原基形成及花器官發(fā)育3個(gè)階段。其中，開(kāi)花誘導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且精細(xì)，受多種因素影響。根據(jù)內(nèi)源信號(hào)和環(huán)境刺激可將開(kāi)花誘導(dǎo)途徑分為光周期途徑[22]、春化途徑[23]、赤霉素途徑[24]、自主途徑[25]以及年齡途徑[11]。高等植物中的年齡途徑是一種非誘導(dǎo)條件下的開(kāi)花調(diào)控途徑。目前的研究表明，miR156-SPL模塊是該途徑中的主要調(diào)控因子，其中miR156和SPL呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式，即miR156可維持植物幼年形態(tài)特征，而SPL則促進(jìn)植物開(kāi)花[7,11]。對(duì)m iR156-SPL上游調(diào)控信號(hào)研究表明，糖信號(hào)和CO2濃度在一定程度上影響miR156-SPL的表達(dá)模式[26-27]。植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中，光合作用產(chǎn)生的糖積累以及環(huán)境中CO2濃度的升高均會(huì)降低miR156的表達(dá)水平[1,26-28]。Yang等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和果糖可以抑制擬南芥miR156的積累，并通過(guò)“脫葉補(bǔ)糖法”證實(shí)了這一觀點(diǎn)；Yu等[28]發(fā)現(xiàn)擬南芥中的糖類(lèi)可以通過(guò)降解miR156的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本來(lái)抑制miR156的表達(dá)。近期，Zhou等[29]進(jìn)一步研究糖信號(hào)和年齡途徑對(duì)miR156的調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)，NUCLEAR FACTOR Y A8(NF-YA8)可直接結(jié)合miR156啟動(dòng)子CCAAT順式作用元件，通過(guò)整合糖信號(hào)和年齡途徑來(lái)調(diào)控miR156的表達(dá)，從而參與植物的營(yíng)養(yǎng)階段轉(zhuǎn)變和開(kāi)花過(guò)程。Guo等[30]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MYB33可結(jié)合miR156A和miR156C的啟動(dòng)子促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，而miR159通過(guò)抑制MYB33從而下調(diào)miR156的表達(dá)。May等[27]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了高濃度CO2會(huì)降低擬南芥miR156的表達(dá)水平，并參與miR156/157-SPLs-miR172-AP2-like通路介導(dǎo)的開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，引導(dǎo)植物的成花轉(zhuǎn)變。此外，當(dāng)擬南芥幼苗光形態(tài)發(fā)生正調(diào)控因子HY5(LONG HYPOCOTYL 5)突變后，miR156的表達(dá)顯著降低[31]；缺磷情況下，擬南芥中miR156表達(dá)上調(diào)[32]，表明miR156的表達(dá)可能受光信號(hào)和養(yǎng)分供給等多種因素的影響[31-32]。

目前，研究發(fā)現(xiàn)miR156-SPL模塊主要通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)開(kāi)花基因影響植物開(kāi)花過(guò)程(圖1)。在擬南芥的莖頂端，AtSPL3/4/5和AtSPL9可以直接激活下 游LEAFY(LFY)、FRUITFULL(FUL)、AGAMOUSLIKE(AGL42)和AP1等MADS-box基因從而促進(jìn)開(kāi)花[38]。在擬南芥的葉片中，AtSPL9通過(guò)激活miR172降低下游AP2-like開(kāi)花抑制基因的表達(dá)水平，形成miR156/157-SPLs-miR172-AP2-like調(diào)控通路，從而促進(jìn)開(kāi)花[12,39]，表明植物在不依賴(lài)外界環(huán)境的情況下依然可以進(jìn)入生殖階段。此外，赤霉素途徑中的轉(zhuǎn)錄抑制因子DELLA蛋白可以通過(guò)與miR156的靶基因SPL互作來(lái)降低SPL的活性。一方面，通過(guò)降低下游MADS-box開(kāi)花基因表達(dá)水平，引起短日照下延遲開(kāi)花；另一方面，通過(guò)miR172-AP2-like途徑，抑制開(kāi)花基因FT的表達(dá)，導(dǎo)致長(zhǎng)日照下開(kāi)花延遲[33]；同時(shí)，Hyun等[40]發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtSPL15還依賴(lài)GA信號(hào)招募MED18和RNA polymerase II，引導(dǎo)下游FUL和miR172b參與開(kāi)花過(guò)程。除參與植物年齡調(diào)控外，miR156-SPL還響應(yīng)植物的春化過(guò)程。AP2-like家族中的TOE1基因表達(dá)導(dǎo)致彎曲碎米薺(Cardamine flexuosa)對(duì)低溫不敏感，無(wú)法正常春化開(kāi)花。TOE1受miR156正向調(diào)控，TOE1和miR156表達(dá)隨植物生長(zhǎng)過(guò)程的推進(jìn)而降低，從而提高彎曲碎米薺的低溫敏感性，誘導(dǎo)開(kāi)花[41]，表明miR156-SPL不僅是年齡調(diào)控開(kāi)花途徑中的重要因子，同時(shí)還通過(guò)整合GA途徑和春化途徑協(xié)同調(diào)控植物開(kāi)花過(guò)程。

圖1 MiR156-SPL參與開(kāi)花、分蘗和果實(shí)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制Figure1 Theregulatory mechanism of miR156-SPL mediation of flowering, tillering and fruit development

2 MiR1 5 6 -SPL調(diào)節(jié)植物分蘗

植物理想株型與作物的質(zhì)量和產(chǎn)量等密切相關(guān)[8,42-43]，培育理想株型結(jié)構(gòu)的品種是目前作物育種的重點(diǎn)，其中分蘗或分枝是決定植物株型結(jié)構(gòu)的重要因素。研究表明，miR156-SPL在分蘗或分枝調(diào)控中具有重要作用[43-44]。水稻中過(guò)表達(dá)SPL14或?qū)⑵渑cmiR156的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行單堿基突變時(shí)，水稻分蘗數(shù)降低，分枝數(shù)增加；對(duì)SPL14進(jìn)行RNAi干擾時(shí)，分蘗數(shù)增多而分枝數(shù)減少[8,42]。而在番茄中，RNAi干擾SPL13表達(dá)植株的表型與過(guò)表達(dá)miR156的表型相似，表現(xiàn)為側(cè)枝數(shù)和營(yíng)養(yǎng)枝數(shù)增加2～3倍[9]，推測(cè)miR156-SPL模塊對(duì)植物株型的調(diào)控作用相對(duì)保守，即miR156通過(guò)抑制SPL表達(dá)促進(jìn)植物分蘗。

對(duì)miR156-SPL進(jìn)行通路分析表明，下游基因TB1/FC1/BRC1可以調(diào)控植物分蘗，其中TB1(Teosinte Branched 1)可以與分蘗促進(jìn)基因MADS57形成異源二聚體，降低MADS57對(duì)D14(DWARF 14)的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而減少分蘗數(shù)[45]。水稻植物理想株型基因IPA1(Ideal Plant Architecture 1)編碼的OsSPL14可以直接與水稻OsTB1的啟動(dòng)子結(jié)合，提高TB1/FC1的表達(dá)[44]。OsmiR156通過(guò)對(duì)OsSPL14轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行切割(cleavage)來(lái)調(diào)控其表達(dá)，當(dāng)OsmiR156識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，OsmiR156對(duì)IPA1抑制作用減弱，從而減少分蘗[42]。此外，miR156-SPL可能與獨(dú)腳金(Striga asiatica)內(nèi)脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(SL)存在聯(lián)系，IPA1可能是miR156和獨(dú)腳金內(nèi)脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的共同靶點(diǎn)[34,44]。在SL信號(hào)通路中，D53(DWARF 53)會(huì)抑制IPA1的轉(zhuǎn)錄激活，而IPA1可以結(jié)合到D53的啟動(dòng)子上激活其表達(dá)，形成一種反饋機(jī)制(feedback loop)[34]。Liu等[35]認(rèn)為小麥(Triticum aestivum)中SPL3和SPL17的表達(dá)受到miR156和D53的抑制，從而降低下游TB1的表達(dá)，促使小麥分蘗數(shù)增多。同時(shí)，miR156可能還參與光信號(hào)(PIF)介導(dǎo)的植物分蘗(分枝)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[46]。Xu等[47]在研究miRNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)調(diào)控水稻分蘗分子機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，OsMIR156d/j的轉(zhuǎn)錄受到RdDM抑制，從而影響成熟miR156及其靶基因IPA1在莖基部的積累，調(diào)控水稻分蘗。綜上，miR156-SPL模塊不僅參與獨(dú)腳金內(nèi)脂信號(hào)途徑，還可響應(yīng)外界光信號(hào)和內(nèi)在DNA甲基化，在植物分蘗調(diào)控中發(fā)揮重要作用，但其潛在的分子機(jī)理仍需深入研究(圖1)。

3 MiR1 5 6 -SPL調(diào)節(jié)植物籽粒(果實(shí))發(fā)育

果實(shí)或籽粒的形態(tài)是決定作物產(chǎn)量的重要因素。Shikata等[7]發(fā)現(xiàn)，AtSPL10可以影響花柄和果莢長(zhǎng)度。通過(guò)對(duì)秈稻高產(chǎn)品種‘HJX74’(籽粒短而寬)和中產(chǎn)品種‘Basmati385’(籽粒長(zhǎng))的籽粒差異進(jìn)行QTL定位，鑒定到一個(gè)對(duì)水稻籽粒大小、形狀和質(zhì)量具有潛在調(diào)控功能的基因OsSPL16/GW8。后續(xù)研究表明，高表達(dá)水平的OsSPL16/GW8可促進(jìn)細(xì)胞分裂和灌漿，影響水稻籽粒寬度和產(chǎn)量；而OsSPL16/GW8功能缺失會(huì)使籽粒細(xì)長(zhǎng)，提高其外觀質(zhì)量。利用QTL和分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)培育出攜帶OsSPL16和qGS3等位基因的‘華標(biāo)1號(hào)’品種，在保證優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)上能使單株籽粒產(chǎn)量提高約14%[48-49]。Wang等[50]發(fā)現(xiàn)，水稻去泛素化酶基因OsOTUB1可促進(jìn)OsSPL14的蛋白酶體降解，當(dāng)OsOTUB1表達(dá)降低或功能缺失時(shí)，OsSPL14積累增加，使水稻單株分蘗數(shù)減少，粒數(shù)和粒重增加，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的目的。Si等[51]利用GWAS對(duì)381個(gè)粳稻品種的籽粒長(zhǎng)和寬進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，由GLW7編碼的OsSPL13可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞大小正向調(diào)控粳稻籽粒形態(tài)，促使籽粒變長(zhǎng)、粒數(shù)增加。

此外，過(guò)表達(dá)miR156的番茄植株果實(shí)和葉片變小、葉數(shù)增多，植株高度降低[18]。對(duì)其靶基因SISPL13進(jìn)行RNAi干擾和敲除發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株表型與過(guò)表達(dá)miR156株系相似，表現(xiàn)為小花數(shù)和果實(shí)數(shù)降低，平均單個(gè)果實(shí)重量減少45%～70%，導(dǎo)致減產(chǎn)約40%[9]。Colourless non-ripening(cnr)是番茄中一種典型的果實(shí)成熟突變體，cnr突變體植株可正常生長(zhǎng)發(fā)育，但果實(shí)不能成熟，果皮呈黃色，果肉呈無(wú)色或白色[52]。Manning等[53]通過(guò)圖位克隆證實(shí)cnr突變體中的LeSPL-CNR屬于SPL家族，其啟動(dòng)子上游存在一段超甲基化區(qū)域，此區(qū)域自發(fā)甲基化會(huì)抑制LeSPL-CNR的表達(dá)從而導(dǎo)致cnr突變體果實(shí)不成熟；利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(virus induced gene silencing, VIGS)將野生型植株LeSPL-CNR沉默發(fā)現(xiàn)其植株表型與cnr突變體相似。Lai等[36]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SISPL-CNR由一個(gè)核定位信號(hào)和兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)SlSPL-CNR被SISnRK1磷酸化，然后由核定位信號(hào)引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核的SlSPL-CNR可依賴(lài)鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合到果實(shí)成熟相關(guān)基因的啟動(dòng)子上，參與番茄果實(shí)成熟過(guò)程。LeSPL-CNR的3'UTR區(qū)域含有SlymiR156/157結(jié)合位點(diǎn)，SlymiR157通過(guò)對(duì)LeSPL-CNRmRNA進(jìn)行切割或抑制其翻譯來(lái)負(fù)調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)基因(LeMADS-RIN,LeHB1,SlAP2a和SlTAGL1)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)果實(shí)成熟。同時(shí)，SlymiR156-LeSPL-CNR還參與果實(shí)軟化過(guò)程[37]。在番茄中過(guò)表達(dá)miR156時(shí)，其植株果實(shí)異常，表現(xiàn)為果實(shí)長(zhǎng)出額外心皮和異常結(jié)構(gòu)。Silva等[54]認(rèn)為這一結(jié)果是由miR156過(guò)表達(dá)導(dǎo)致TOMATO KNOTTED2(LeT6/TKN2)和GOBLET(GOB)表達(dá)上調(diào)引起，暗示miR156-SPL可通過(guò)參與維持子房組織的分生狀態(tài)，從而控制果實(shí)發(fā)育。推測(cè)miR156-SPL模塊參與籽粒(果實(shí))形態(tài)建成和產(chǎn)量調(diào)控(圖1)，進(jìn)一步挖掘miR156-SPL在果實(shí)發(fā)育調(diào)控中的機(jī)理將有助于分子育種。

4 MiR1 5 6 -SPL調(diào)節(jié)植物脅迫響應(yīng)

4.1 環(huán)境溫度脅迫

溫度不僅限制了植物的地理分布，也影響著植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。高溫是植物普遍面臨的脅迫之一，植物不同時(shí)期響應(yīng)熱脅迫的能力不同，通常營(yíng)養(yǎng)期的耐高溫能力較強(qiáng)，而生殖期尤其是開(kāi)花期則較差[55-56]。MiR156-SPL可以調(diào)控植物對(duì)環(huán)境溫度的響應(yīng)。46℃高溫處理蕪菁(Brassica rapa) 1 h，miR156 h和miR156 g可以被誘導(dǎo)表達(dá)，但是SPL2受miR156的抑制其表達(dá)量降低[57]。與此類(lèi)似，40℃高溫也可以誘導(dǎo)小麥miR156的表達(dá)上調(diào)[58]。Stief等[59]認(rèn)為miR156可通過(guò)調(diào)控SPL響應(yīng)持續(xù)的高溫脅迫，其原理可能是高溫誘導(dǎo)植物體內(nèi)miR156表達(dá)升高，抑制下游靶基因SPL的表達(dá)，從而延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)期，避免植物在高溫條件下開(kāi)花，達(dá)到響應(yīng)熱脅迫的效果。Ding等[60]認(rèn)為miR156-SPL可以通過(guò)抑制下游相關(guān)熱響應(yīng)基因來(lái)適應(yīng)環(huán)境溫度變化，也可以直接抑制熱激轉(zhuǎn)錄因子HsFA2的轉(zhuǎn)錄參與到熱脅迫分子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。MiR156-SPL還在植物響應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮作用。4℃條件下野生型和過(guò)表達(dá)miR156k水稻植株對(duì)低溫的敏感性存在顯著差異，可能與miR156k的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[61]；Zhang等[62]發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)(Camellia sinensis)中miR156的兩個(gè)靶基因CsSBP8和CsSBP12對(duì)低溫敏感，推測(cè)其參與低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程。

4.2 其他非生物脅迫響應(yīng)

除溫度脅迫外，miR156-SPL還參與其他非生物脅迫的調(diào)控過(guò)程。對(duì)鹽生植物檉柳(Tamarix chinensis)的研究表明，鹽脅迫后1 h可能是miR156-SPL轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)[15]；過(guò)表達(dá)NtabSPL6煙草其發(fā)芽率提高，電解質(zhì)滲透率和過(guò)氧化氫(H2O2)含量降低，抗鹽能力增強(qiáng)[63]；過(guò)表達(dá)miR156白樺(Betula platyphylla)植株在鹽脅迫12 d后，其鹽害指數(shù)顯著高于對(duì)照。復(fù)水后轉(zhuǎn)基因植株的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降，而H2O2和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量上升，表明提高miR156的表達(dá)水平能降低植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[64]；Ding等[65]發(fā)現(xiàn)，miR156-SPL可以通過(guò)調(diào)節(jié)玉米(Zea mays)的生理代謝及側(cè)根形態(tài)特征來(lái)響應(yīng)鹽脅迫。短期干旱脅迫后復(fù)水處理，過(guò)表達(dá)VpSPL16擬南芥植株復(fù)活，而對(duì)照全部死亡。對(duì)過(guò)表達(dá)植株的生理指標(biāo)和下游已知脅迫基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其活性氧積累較少而AtCOR15a表達(dá)量上調(diào)，表明VpSPL16可能通過(guò)參與活性氧的清除過(guò)程以及與下游脅迫基因相互作用，從而提高擬南芥植株的耐鹽性和耐旱性[66]。MiR156-SPL雖響應(yīng)多種非生物脅迫，但其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究尚不深入，如目前對(duì)miR156-SPL如何感知外界脅迫信號(hào)并通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因來(lái)響應(yīng)逆境的機(jī)理研究較少。

4.3 生物脅迫

植物在生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，容易受到諸如細(xì)菌、病毒、真菌、昆蟲(chóng)等病蟲(chóng)害的影響，而miR156-SPL模塊參與植物響應(yīng)生物脅迫的過(guò)程[67]。TIRNB-LRR是植物中的一類(lèi)抗病基因，煙草抗花葉病毒的N基因就屬于此類(lèi)抗病基因。研究發(fā)現(xiàn)，NbSPL6在抗煙草花葉病毒中發(fā)揮著重要的作用[63,68]?；颐咕寝r(nóng)業(yè)生產(chǎn)中引起植物病害的主要病原菌之一，當(dāng)經(jīng)濟(jì)作物感染后，會(huì)因采后腐爛而造成損失[69]。張麗[63]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NtabSPL6-2擬南芥植株對(duì)灰霉菌有明顯抗性，轉(zhuǎn)基因NtabSPL6植株葉片萎蔫程度較輕且壞死區(qū)域的面積較小，其抗性相關(guān)基因PR1和PR5的表達(dá)水平均比野生型的侵染葉片高。病原菌脅迫下，過(guò)表達(dá)miR156植株比對(duì)照植株具有更強(qiáng)的SOD、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性，相關(guān)抗病基因MYB106、MYB61、RPP13、RPM1的表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)miR156可能通過(guò)增強(qiáng)相關(guān)抗病基因的表達(dá)來(lái)提高白樺的抗病能力[64]。茉莉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase，JMT)是抗病信號(hào)物質(zhì)茉莉酸甲酯(methyl Jasmonate，MeJA)合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶[70]，擬南芥中過(guò)表達(dá)AtJMT使AtSPL2的表達(dá)下調(diào)，表明AtSPL2可能參與MeJA介導(dǎo)的抗病途徑[71]。

MiR156-SPL模塊還影響著植物的抗蟲(chóng)能力。褐飛虱是水稻生產(chǎn)中主要蟲(chóng)害之一，會(huì)引起稻株倒伏并誘導(dǎo)其他水稻病害。研究發(fā)現(xiàn)miR156-SPL14通過(guò)調(diào)控茉莉酸(jasmonic acid，JA)通路中MPK6等基因的表達(dá)，影響JA和JA-Ile(jasmonoyl-isoleucine)的含量從而降低褐飛虱的產(chǎn)卵量和存活率[21]。JAZs在JA調(diào)控途徑中起負(fù)調(diào)控作用，而擬南芥AtSPL9可以直接結(jié)合到JAZs的N端。隨著擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育，AtSPL9表達(dá)量逐漸增加，JAZs不斷積累，使得擬南芥中JA系統(tǒng)防御能力下降、抗蟲(chóng)能力降低[72]。

5 MiR1 5 6 -SPL的其他作用

圖2 MiR156-SPL模塊的多種調(diào)控功能Figure 2 The various regulatory functions of the miR156-SPL module

MiR156-SPL模塊通過(guò)調(diào)節(jié)二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控花青素的合成，從而參與植物花色形態(tài)建成。Yu等[73]和Gou等[74]發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)miR156的活性可以促進(jìn)花青素的積累，而AtSPL9負(fù)調(diào)控花青素的合成，并認(rèn)為miR156負(fù)調(diào)控SPL表達(dá)，而SPL通過(guò)與花青素合成途徑中MYB-bHLH-WD40復(fù)合體上MYB蛋白PAP1相互作用抑制DFR的表達(dá)，通過(guò)miR156-SPL-DFR信號(hào)通路影響花青素合成。而在芍藥(Paeonia lactiflora)中同樣證實(shí)了miR156-SPL-DFR在花青素合成中三者的負(fù)調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制[75]。MiR156-SPL還參與植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素缺乏的響應(yīng)。MiR399家族在植物低磷響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，而SPL3可以結(jié)合到PLDZ2、Pht1;5、miR399f的GTAC順式元件上，通過(guò)miR156-SPL3-Pht1;5(或miR156-SPL3-PLDZ2和miR156-SPL3-miR399f)途徑調(diào)控?cái)M南芥對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)[76-77]。除此之外，MiR156-SPL還具有調(diào)節(jié)植物葉片表型、調(diào)控植物激素變化、維持植物育性、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡等多種功能(圖2、表2)。

6 草類(lèi)植物中miR1 5 6 -SPL的研究進(jìn)展

基于紫花苜蓿(Medicago sativa) miR156-SPL的功能研究表明，miR156-SPL具有介導(dǎo)其營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)變和干旱脅迫響應(yīng)的重要作用。SPL13是目前紫花苜蓿中研究較為深入的SPL成員。紫花苜蓿miR156-SPL13可以調(diào)控莖和葉片形態(tài)、植株分枝和開(kāi)花時(shí)間，當(dāng)沉默SPL13時(shí)植株表現(xiàn)為側(cè)枝數(shù)增多、節(jié)間變短、開(kāi)花延遲，而過(guò)表達(dá)miR156不僅可以延遲紫花苜蓿的開(kāi)花時(shí)間，還會(huì)促進(jìn)根瘤形成和根系生長(zhǎng)，增加10%的生物產(chǎn)量[86-88]。干旱脅迫可以誘導(dǎo)miR156表達(dá)，F(xiàn)eyissa等[89]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR156植株可通過(guò)提高氣孔導(dǎo)度、增加ABA含量、改善根系結(jié)構(gòu)形態(tài)來(lái)增強(qiáng)抗旱能力。Arshad等[90]通過(guò)構(gòu)建SPL13沉默植株、過(guò)表達(dá)WD40-1植株和RNAi干擾WD40-1植株，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SPL13可直接結(jié)合到DRF啟動(dòng)子上，基于此提出miR156響應(yīng)紫花苜蓿的抗旱途徑：干旱誘導(dǎo)miR156表達(dá)從而引起SPL13沉默和WD40-1水平升高、DFR表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)花青素的積累，并通過(guò)調(diào)節(jié)紫花苜蓿的各種發(fā)育、生理生化過(guò)程，提高其抗旱能力。Gou等[91]發(fā)現(xiàn)，MsSPL8能調(diào)控紫花苜蓿分枝并促進(jìn)蒺藜苜蓿腋芽萌發(fā)和參與GA信號(hào)調(diào)控。而MsSPL8的下調(diào)會(huì)增加紫花苜蓿的分枝數(shù)，加速其再生過(guò)程，提高紫花苜蓿耐鹽性和抗寒性。表明SPL在苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。

表2 MiR156-SPL最新研究進(jìn)展Table 2 Recent research progresson miR156-SPL

柳枝稷(Panicum virgatum)作為一種優(yōu)良的牧草和能源作物，其分蘗數(shù)是決定生物量的關(guān)鍵因素。Fu等[43]發(fā)現(xiàn)，miR156的中等表達(dá)會(huì)增加其分蘗數(shù)，提高生物產(chǎn)量58%～101%。而過(guò)表達(dá)PvSPL1/2會(huì)使柳枝稷分蘗減少，生物產(chǎn)量顯著降低；抑制SPL2活性可減少木質(zhì)素含量，增加細(xì)胞壁糖化效率，從而提高乙醇產(chǎn)量和飼料消化率[13]。此外，過(guò)表達(dá)miR156會(huì)誘導(dǎo)柳枝稷氣生芽(aerial axillary bud)的形成；抑制靶基因SPL4表達(dá)同樣可促進(jìn)芽的形成、增加分蘗數(shù)以此提高生物量[92]。近期研究證實(shí)了miR156-SPL具有調(diào)控柳枝稷開(kāi)花的作用，下調(diào)SPL7和SPL8的柳枝稷株型高大、花序結(jié)構(gòu)改變、分蘗增多、鮮重和干重顯著提高，其體外干物質(zhì)消化率和總可消化養(yǎng)分提高，木質(zhì)素含量下降；SPL7和SPL8通過(guò)直接上調(diào)SEPALLATA3(SEP3)和MADS32調(diào)控營(yíng)養(yǎng)相變和開(kāi)花，但受SPL調(diào)控的SEP3和MADS32與擬南芥中AP1/FUL非同源基因[93]。表明SPL雖然有調(diào)控植物開(kāi)花的功能，但其調(diào)控基因存在物種特異性。

鴨茅(Dactylis glomerata)是多年生禾本科牧草，因其產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、耐逆性強(qiáng)等特點(diǎn)被廣泛種植。在我國(guó)西南地區(qū)，鴨茅常與紫花苜蓿、白三葉(Trifolium repens)等優(yōu)質(zhì)豆科牧草混播，但鴨茅開(kāi)花時(shí)間與混播草種不同步，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。Feng等[94-95]通過(guò)分析早花鴨茅‘寶興’不同生育時(shí)期miRNAs的動(dòng)態(tài)調(diào)控、比較早花鴨茅‘寶興’和晚花鴨茅‘德納塔’的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異來(lái)研究鴨茅開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)miR156在春化前期高表達(dá)，隨著生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期推進(jìn)其表達(dá)逐漸降低。而SPL與miR156呈現(xiàn)完全相反的表達(dá)模式，推測(cè)miR156-SPL參與調(diào)控鴨茅開(kāi)花和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，為培育不同成熟期的鴨茅品種奠定理論基礎(chǔ)。

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)株型小、生長(zhǎng)周期短、自花授粉、易遺傳轉(zhuǎn)化，是研究禾本科植株基因功能的優(yōu)良模式植物[96]。An等[97]研究發(fā)現(xiàn)，16℃低溫下BdVIL4-RNAi二穗短柄草植株開(kāi)花延遲、分枝數(shù)增多，推測(cè)BdVIL4可能參與溫敏開(kāi)花調(diào)控途徑及分枝發(fā)育調(diào)控過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BdVIL4-RNAi二穗短柄草體內(nèi)miR156的表達(dá)量顯著上升，其靶基因SPLs表達(dá)下調(diào)。值得注意的是，水稻OsSPL14同源基因BdSPL9-2的表達(dá)同樣下調(diào)，說(shuō)明BdVIL4可能通過(guò)影響miR156和SPL的表達(dá)參與二穗短柄草的分枝與開(kāi)花調(diào)控過(guò)程。此外，通過(guò)同源克隆得到與擬南芥AtsSPL4相似度較高的草地早熟禾(Poa pratensis)PpSPL4，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核中，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PpSPL4在花組織中高表達(dá)，而在初花期和中花期的表達(dá)量顯著低于繁花期，且該過(guò)程受到GA和糖信號(hào)的誘導(dǎo)，初步認(rèn)為該基因與花芽分化有關(guān)[98]。同樣利用同源克隆的方法獲得日本結(jié)縷草(Zoysia japonica)ZjSPL4基因，發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞核，而對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GA、ABA、蔗糖、低溫處理均會(huì)影響ZjSPL4的表達(dá)，說(shuō)明ZjSPL4可能參與調(diào)控結(jié)縷草的花芽分化及非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程[99]。

7 展望

綜上所述，關(guān)于miR156-SPL功能的研究雖然起步較早，但大多集中于模式植物和雙子葉植物中。草類(lèi)植物中的牧草作為草食家畜飼養(yǎng)過(guò)程中重要的飼料來(lái)源，其品質(zhì)和產(chǎn)量與畜牧業(yè)發(fā)展密切相關(guān)。開(kāi)花期是決定牧草品質(zhì)和種子產(chǎn)量的關(guān)鍵時(shí)期，開(kāi)花后牧草營(yíng)養(yǎng)含量降低，飼用價(jià)值大大下降。MiR156-SPL參與調(diào)控植物開(kāi)花過(guò)程，如模式植物擬南芥miR156-SPL參與年齡途徑調(diào)控開(kāi)花的分子機(jī)制基本清晰，但關(guān)于牧草miR156-SPL在開(kāi)花機(jī)制中的研究較少，禾本科牧草開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與雙子葉植物開(kāi)花調(diào)控是否存在差異仍需進(jìn)一步探討。分蘗是影響牧草產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，分蘗數(shù)增加，草產(chǎn)量隨之提高。水稻、小麥的miR156-SPL在調(diào)控植物株型結(jié)構(gòu)、調(diào)控果實(shí)(籽粒)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，而關(guān)于牧草miR156-SPL調(diào)控分蘗和響應(yīng)脅迫的功能及分子機(jī)理仍需進(jìn)一步深入。總體而言，隨著測(cè)序技術(shù)及基因功能驗(yàn)證手段的發(fā)展，進(jìn)一步挖掘miR156-SPL在牧草開(kāi)花、分蘗和響應(yīng)脅迫中的作用及潛在分子調(diào)控機(jī)制，將有助于利用分子技術(shù)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的牧草品種。