髓系來源抑制性細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響

吳陳新 許 雪 魏 方 蔡樹華

我國肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增漲趨勢，雖然手術(shù)、放療、化療和靶向治療方法的不斷進(jìn)步使肺癌患者的總生存期(overall survival，OS)時間延長，但仍難有質(zhì)的飛越。免疫抑制的微環(huán)境是腫瘤發(fā)生與侵襲的關(guān)鍵，腫瘤細(xì)胞可以重塑微環(huán)境，反之重塑的微環(huán)境能刺激腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展。尋找微環(huán)境中生物標(biāo)志物評估惡性腫瘤預(yù)后是目前研究的新方向，而髓系來源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是近年來研究的熱點(diǎn)之一。目前，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中MDSCs可以分泌多種抑制T淋巴細(xì)胞的物質(zhì)，減低機(jī)體的免疫監(jiān)視，增加腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，使微環(huán)境更利于腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。在多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤中，MDSCs水平與預(yù)后的相關(guān)性已被報道，而關(guān)于非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的MDSCs水平與預(yù)后關(guān)系卻鮮有研究，基于此本研究分析MDSCs與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月至2020年5月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○一醫(yī)院腫瘤診療中心及心胸外科初治的NSCLC患者54例為試驗(yàn)組，年齡44～78歲，平均(61.4±11.5)歲，男性35例，女性19例。收集患者臨床資料,包括年齡、性別、吸煙狀態(tài)、臨床分期、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平、美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)體力評分和OS。臨床分期和ECOG評分參照2016年中國臨床腫瘤學(xué)會NSCLC診療指南，所有入組病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。收集同期本院體檢中心健康人30例為對照組，男性18例，女性12例，平均年齡(58.2±9.6)歲。兩組對象性別、年齡、吸煙狀態(tài)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。排除傳染病及自身免疫性疾病，入組前1個月內(nèi)未接受過輸血、免疫增強(qiáng)劑和/或免疫抑制劑治療。本研究方案經(jīng)本院道德倫理委員會審核通過，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 試劑 CD3-FITC/HLA-DR-PE熒光單克隆抗體試劑、CD45-PC5熒光單克隆抗體試劑、CD14異硫氰酸熒光素抗體(anti-CD14-FITC)及Cytomics FC500MPL流式細(xì)胞儀均購于美國貝克曼庫爾特有限公司(Beckman Coulter)。紅細(xì)胞裂解液(ACK Lysis Buffer)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自青島天祺生物科技有限公司。上述試劑均由合肥金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司提供。

1.3 檢測方法 采集所有對象空腹靜脈血10 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝處理后編號、登記。① 標(biāo)本置入離心機(jī)中以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速15 min；靜置后將上層血漿吸入1.5 mL EP管中，按順序編號標(biāo)本管及對照管，并放入-70℃的冰箱進(jìn)行冷凍備用。②取等量生理鹽水重懸下層細(xì)胞，靜止后緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液。再次以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后將云霧狀單核細(xì)胞層用吸管轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中；重復(fù)二次重懸細(xì)胞、離心、棄去上清。③加入PBS約2 mL洗滌細(xì)胞，制得外周血單個核細(xì)胞懸液。取100 μL于流式管中；向各管細(xì)胞中加入anti-CD14-FITC、anti-CD3-FITC、anti-CD45-PC5抗體各10 μL；4℃避光環(huán)境中孵育30 min后，再用2 mL PBS洗滌細(xì)胞1次。④最后加入適量固定液300～500 μL。用流式細(xì)胞儀收集10 000個細(xì)胞/管，應(yīng)用Cytomics FC500MPL流式細(xì)胞儀分析軟件提取數(shù)據(jù)，獲取并分析標(biāo)本管與對照管中CD14細(xì)胞里CD14HLA-DRlow/-MDSC細(xì)胞所占的百分比。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察兩組對象外周血MDSCs水平；試驗(yàn)組OS、臨床資料與MDSCs的相關(guān)性；試驗(yàn)組27例患者治療前后MDSCs水平的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)資料對比 試驗(yàn)組54例初診NSCLC患者中，1例失訪排除。剩余53例初治NSCLC患者，不同年齡、性別、吸煙情況患者外周血MDSCs水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)；不同臨床分期、LDH水平、ECOG評分患者外周血MDSCs水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 NSCLC患者外周血中MDSCs水平與相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

2.2 外周血中MDSCs表達(dá)對比 試驗(yàn)組CD14HLA-DRMDSC細(xì)胞比例為(23.56±11.01)%，與對照組的(7.28±2.43)%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=10.419，

P

<0.001)。試驗(yàn)組中追蹤了27例患者，經(jīng)過手術(shù)、放療和/或2個及以上周期化療后，MDSCs水平為(12.30±5.37)%，較治療前的(23.56±11.01)%(53例群體水平)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=6.147，

P

<0.001)。2.3 MDSCs對NSCLC患者OS的影響 53例NSCLC患者隨訪至2020年9月或死亡為止。中位隨訪時間為21個月。按NSCLC患者M(jìn)DSCs的平均值(23.56%)為截斷值，將患者分成<23.56%和≥23.56%兩組，其中位生存期分別為20和>36(個月)。繼而采用Kaplain-Meier法繪制生存曲線，并進(jìn)行兩組生存率比較的Log-Rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，具有較高M(jìn)DSCs水平的患者預(yù)后更差(Log-Rand

χ

=20.834，

P

<0.001)。見圖1。

圖1 MDSCs水平對NSCLC患者生存期的影響

2.4 NSCLC患者預(yù)后因素分析 建立COX比例風(fēng)險回歸模型，以NSCLC患者預(yù)后狀況為因變量，賦值1=死亡，0=生存。以表2所列各指標(biāo)/因素作為自變量，并經(jīng)臨床和統(tǒng)計專家會商確定賦值方案(見表2)。

單因素分析結(jié)果顯示，臨床分期、LDH水平、吸煙情況、ECOG評分、MDSCs水平等5個指標(biāo)均與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)聯(lián)(

P

<0.05)。見表2。

表2 非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的單因素COX分析結(jié)果

再將單因素分析中

P

<0.10的指標(biāo)(共5個)作為自變量納入多因素分析，結(jié)果顯示臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)及MDSCs水平(較高水平)是NSCLC患者預(yù)后的危險因素(

P

<0.05)。見表3。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的多因素COX分析結(jié)果

3 討論

機(jī)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及進(jìn)展與免疫抑制性微環(huán)境相關(guān)，免疫抑制性細(xì)胞、抑制分子和抑制性細(xì)胞因子為主要構(gòu)成成分。其中免疫抑制性細(xì)胞主要包括MDSCs、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等。MDSCs是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素，一方面表達(dá)多種促血管形成因子促進(jìn)腫瘤新生血管的形成；另一方面分泌多種細(xì)胞因子抑制宿主固有免疫及減弱適應(yīng)性免疫，使免疫細(xì)胞減弱或失去清除和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)，人類MDSCS研究中并沒有明確統(tǒng)一的免疫表型。參照小鼠MDSCs分型，人類MDSCs分為2大類：單核細(xì)胞型(M-MDSCs)和粒細(xì)胞型(PMN-MDSCs)，因?yàn)檠簶颖局需b定PMN-MDSCs存在一定的技術(shù)問題，實(shí)際研究中關(guān)于M-MDSCs的研究項(xiàng)目較多，常以CD14HLA-DRlow/-為標(biāo)志物。本研究中選取MDSCs的表型也是參照此研究基礎(chǔ)。

本研究檢測了NSCLC患者和健康體檢者外周血MDSCs水平，并分析外周血MDSCs水平和相關(guān)臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示NSCLC患者外周血MDSCs水平明顯高于健康體檢者，表明腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)和招募MDSCs進(jìn)入外周血，并增殖、分化，使機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)臨床分期、血清LDH水平、ECOG評分與外周血MDSCs水平相關(guān)。臨床分期越晚、LDH值越大、ECOG體力評分越差的患者，其外周血MDSCs水平越高。臨床分期體現(xiàn)NSCLC的侵襲度，血清LDH和ECOG評分被認(rèn)為是NSCLC預(yù)后不良因素。因此，從側(cè)面反映MDSCs高水平與肺癌患者預(yù)后不良相關(guān)。安曉華等研究表明，NSCLC臨床分期與外周血MDSCs正相關(guān)，可作為判斷預(yù)后的一個獨(dú)立標(biāo)志；王靜之等和王治寬等也證實(shí)MDSCs可以作為判斷惡性腫瘤患者預(yù)后的一個生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過手術(shù)、放化療等手段，可使惡性腫瘤的MDSCs水平下降，其可能原因：①患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷降低，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的活性因子如白細(xì)胞介素-6、前列腺素和環(huán)加氧酶-2等減少，誘導(dǎo)MDSCs聚集的能力下降，導(dǎo)致外周血MDSCs水平降低；②細(xì)胞毒性藥物對外周血的MDSCs具有特異性殺傷作用。大量的動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)培美曲塞、順鉑和吉西他濱可優(yōu)先清除MDSCs，增加CD8T細(xì)胞的應(yīng)答能力。

在研究NSCLC患者OS與MDSCs水平的單因素分析中發(fā)現(xiàn)，MDSCs水平低于截斷值的患者生存期明顯優(yōu)于MDSCs高于截斷值的患者。多因素分析表明，MDSCs系NSCLC患者的獨(dú)立危險因素。但由于本研究周期短，未能對復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者的MDSCs水平進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，還不能直接證明MDSCs為判斷NSCLC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，今后會在隨訪工作中進(jìn)一步研究。綜上所述，檢測外周血MDSCs水平，可作為判斷NSCLC患者預(yù)后的重要指標(biāo)。