青牛膽不定芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)研究

覃芳妮 盧娟 李莉莉 吳俊 孫熹

摘 要：以青牛膽頂芽和腋芽為外植體，分別采用1/2MS、MS、1/2MS（改良）、MS（改良）、N6、ER、SH培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分析添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及配比對(duì)頂芽和腋芽誘導(dǎo)、增殖及生根的影響。結(jié)果表明：MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L能誘導(dǎo)青牛膽外植體生長(zhǎng);最佳增殖培養(yǎng)基為MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，其增殖系數(shù)達(dá)到6;MS（改良）+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L能誘導(dǎo)青牛膽叢生芽生根，其生根率達(dá)93.3%。

關(guān)鍵詞：青牛膽;頂芽;腋芽;誘導(dǎo);生根

中圖分類號(hào) S567.239文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）10-0021-03

Adventitious Bud Induction and Rooting Culture of Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep.

QIN Fangni et al.

（Yulin Foreserch Research Institute，Yulin 537501，China）

Abstract：The shoot segments of Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep. were used as explants materials， and 1/2MS、MS、1/2MS（improve）、MS（improve）、N6、ER、SH were used as the basic medium to study the effects of different exogenous hormones and their ratios on axillary bud initiation，proliferation and rooting of tissue cultured seedings.The results show that suitable medificient for axillary bud initiation is MS（improve）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L; The optimal proliferation medium for axillay buds is MS（improve）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，and the proliferation coefficient reaches 6; The optimum rooting formula selscted in this study is MS（improve）+NAA 0.5mg/L+2， 4-D 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L， the rooting rate is 93.3%.

Key words： Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep.; Terminalbud; Axillarybud; Induce; Rooting

青牛膽（Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep.）為防己科青牛膽屬常綠纏繞藤本植物[1]。全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的青牛膽屬植物有30多種，我國(guó)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的有11種，其中6種具有藥用價(jià)值[2]。青牛膽的藥用價(jià)值極高，其塊根可以治療咽喉炎、扁桃體炎、上呼吸道感染、氣管炎、口腔潰瘍等疾病[3-5];其水、醇提取物能明顯阻止因腎上腺素誘導(dǎo)的血糖過高[6]。據(jù)報(bào)道，青牛膽在抗幽門螺桿菌[7]、抑菌[8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10]、抗輻射[11]及改善心腦血管疾病[12]等方面也具有明顯的改善作用。由于青牛膽的藥用價(jià)值極高，近年來野生青牛膽被過度采挖，逐漸成為瀕危物種。為滿足市場(chǎng)需求，有必要研究青牛膽的無性繁殖及人工栽培技術(shù)。為此，筆者對(duì)青牛膽快繁技術(shù)進(jìn)行了研究，以期為實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐，為建立高效、優(yōu)質(zhì)的青牛膽外植體組織培養(yǎng)系統(tǒng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 外植體選取 在廣西玉林市陸川縣大橋鎮(zhèn)陸透村，選擇生長(zhǎng)旺盛、枝條無病蟲害的優(yōu)株，剪取約30cm長(zhǎng)并帶有腋芽的枝條，放入干凈塑料袋密封好，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。選用頂芽和未老化的腋芽枝條作為外植體。用自來水沖洗表面塵土，然后置于飽和洗衣粉溶液中7min，之后流動(dòng)自來水沖洗1h，置于超凈工作臺(tái)備用。

1.2 無菌化處理 用75%酒精消毒0.5、1、2min，然后用無菌水清洗2次，再置于0.1% HgCl2溶液中10、20min，最后用無菌水清洗5次。3個(gè)正交試驗(yàn)處理青牛膽外植體，把消毒過的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基以1/2MS、MS、改良1/2MS、改良MS、N6、ER、SH培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加4g/L高強(qiáng)度瓊脂、30g/L蔗糖濃度，用1mol HCl和1mol NaOH把培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8～6.2，隨后把培養(yǎng)基分裝到350mL的組培專用廣口瓶中，121℃滅菌25min。接種后培養(yǎng)條件為溫度（28±2）℃，暗培養(yǎng)7d，然后置于光照強(qiáng)度為1200～1700Lx，光照時(shí)間超過10h/d，培養(yǎng)15d。每天觀察記錄不同消毒方法處理的外植體污染率及外植體生長(zhǎng)情況。

1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 把消毒過的頂芽、腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，頂芽、腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的因素及水平為：6-BA 0.5mg/L，NAA 0.25mg/L，以1/2MS、MS、1/2MS（改良）、MS（改良）、N6、SH為基本培養(yǎng)基，添加4g/L高強(qiáng)度瓊脂、30g/L蔗糖濃度，每種處理20瓶，每瓶接種1～2個(gè)芽，每7d觀察記錄其誘導(dǎo)情況。

根誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出根的芽數(shù)/接入總芽數(shù)×100

1.4 添加配比不同激素 將相同條件下得到的大小較一致的叢生芽，在無菌環(huán)境下剪取1～2cm轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基以1/2MS（改良）、MS（改良）為基本培養(yǎng)基，添加4g/L高強(qiáng)度瓊脂、30g/L蔗糖濃度，分別添加6-BA 0.5mg/L、NAA 0.25mg/L、KT 0.25mg/L、NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L、NAA 0.5mg/L+KT 0.25mg/L、NAA 0.25mg/L+KT 0.5mg/L，共設(shè)計(jì)8個(gè)處理組合，接種10瓶，每瓶1～2個(gè)叢生芽，每7d觀察記錄其生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)。

[增殖系數(shù)=總芽數(shù)/接入芽數(shù)]

1.5 生根培養(yǎng) 把青牛膽叢生植株（有綠色葉子，長(zhǎng)度為3～4cm）接種到生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基以MS（改良）為基本培養(yǎng)基，加入4g/L高強(qiáng)度瓊脂、30g/L蔗糖濃度，分別加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA 0.5mg/L、IAA 0.2mg/L、IBA 0.2mg/L、2，4-D（0.2mg/L、0.5mg/L），共設(shè)計(jì)8個(gè)處理，每個(gè)處理30瓶，每7d記錄其生長(zhǎng)及生根情況。

1.6 培養(yǎng)條件 除另外說明外，無性繁殖試驗(yàn)所用到的1/2MS、MS、1/2MS（改良）、MS（改良）、N6、ER、SH培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加4g/L高強(qiáng)度瓊脂、30g/L蔗糖濃度，用1mol HCl和1mol NaOH把培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8～6.2，隨后把培養(yǎng)基分裝到350mL的組培專用廣口瓶中，121℃滅菌25min。接種后培養(yǎng)條件為溫度（28±2）℃，暗培養(yǎng)7d，然后置于光照強(qiáng)度為1200～1700Lx，光照時(shí)間超過10h/d，培養(yǎng)周期60d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)青牛膽外植體污染的影響 由表1可知，不同消毒處理對(duì)青牛膽外植體的無菌化具有一定的影響。在酒精和氯化汞處理時(shí)間不長(zhǎng)的條件下，青牛膽的外植體污染率極高，甚至達(dá)到96%;延長(zhǎng)酒精和氯化汞消毒處理時(shí)間對(duì)青牛膽外植體無菌化具有顯著作用，但消毒時(shí)間較短或過長(zhǎng)的情況下，青牛膽外植體污染率均有所增加。由此可見，對(duì)青牛膽外植體無菌化最佳的消毒方法為：用75%酒精消毒2min，然后用無菌水清洗2次，之后放到0.1%氯化汞的玻璃瓶中消毒20min，期間不斷振動(dòng)，以便外植體滅菌徹底，最后用無菌水清洗5次。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)青牛膽外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響 由表2可知，1/2MS培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、改良1/2MS培養(yǎng)基、改良MS培養(yǎng)基對(duì)青牛膽無菌化的外植體都具有誘導(dǎo)作用，但改良MS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況最好，其嫩芽生長(zhǎng)明顯，葉片翠綠，植株增高。

2.3 不同激素配比對(duì)青牛膽叢生芽增殖的影響 由表3可知，青牛膽叢生芽在處理F的增殖效果最好，即在改良MS培養(yǎng)基中加入6-BA 0.5mg/L和NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，叢生芽增殖系數(shù)增大，莖部增粗，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，生命力旺盛，基部平均有5～6個(gè)分枝。由此可見，6-BA和NAA不同的濃度組合與KT不同的濃度組合作為植物生長(zhǎng)激素，對(duì)青牛膽叢生芽生長(zhǎng)、增殖均能產(chǎn)生不同的影響，其中增殖最高的培養(yǎng)基為MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，誘導(dǎo)出的植株生長(zhǎng)最快，分枝最多，植株最高。

2.4 不同生長(zhǎng)激素配比對(duì)青牛膽生根的影響 待叢生芽長(zhǎng)出完整葉子后，接種到含有不同生長(zhǎng)激素的生根培養(yǎng)基中，20d后統(tǒng)計(jì)根誘導(dǎo)率和每個(gè)叢生芽的根條數(shù)。由表4和圖1可知，在NAA和2，4-D濃度相同的情況下，IBA較IAA對(duì)青牛膽生根效果更好，其誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)出的根數(shù)均較IAA高。由此可見，最適合青牛膽生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS（改良）+NAA 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L。

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞在理論上都存在全能性，任何植物的器官或者組織都能作為組織培養(yǎng)的外植體[13]。青牛膽的頂芽和腋芽可以通過組織培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)叢生芽增殖及生根，長(zhǎng)成一棵完整的苗。這與葛曉改[14]等以大黃藤（與青牛膽同為防己科植物）莖尖作為外植體，陳加利等[15]以嫩芽組織培養(yǎng)出寬筋藤（與青牛膽同為防己科植物）誘導(dǎo)分化成新植株的結(jié)果保持一致。

外植體表面滅菌一般采用酒精、次氯酸鈉、氯化汞及高錳酸鉀等通過不同組合進(jìn)行。氯化汞處理時(shí)間過短，殺菌不徹底，易導(dǎo)致外植體污染嚴(yán)重;時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)對(duì)組織細(xì)胞起到殺傷作用[16]。本研究結(jié)果表明，青牛膽外植體最佳的消毒方法是用飽和洗衣粉水浸泡7min，流動(dòng)自來水沖洗1h，然后經(jīng)過75%酒精消毒5min，過2次無菌水，置于0.1% HgCl2 溶液中20min，最后用無菌水清洗5次。該方法污染率低，并有利于青牛膽外植體轉(zhuǎn)接。

MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L能誘導(dǎo)青牛膽頂芽和腋芽外植體生長(zhǎng)。最佳增殖培養(yǎng)基為MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，其增殖系數(shù)達(dá)到6。說明KT對(duì)青牛膽的增殖具有明顯作用，在沒有KT的情況下青牛膽增殖系數(shù)低，隨著KT濃度的增加其增殖系數(shù)也有所提高。MS（改良）+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L能誘導(dǎo)青牛膽叢生芽生根，其生根率達(dá)93.3%。說明IBA較IAA更能促進(jìn)青牛膽不定芽生根。在NAA和2，4-D濃度相同的情況下，IBA較IAA對(duì)青牛膽生根效果更好，其誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)出的根數(shù)均較IAA高。

參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員.中國(guó)植物志（第30卷第一分冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，2004：19.

[2]馬亞娟，白文婷，朱小芳，等.青牛膽屬藥用植物研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2017，12（15）：1733-1736.

[3]李洪萍，解富英.金木利咽茶治療慢性咽喉炎108例[J].中國(guó)民間療法，2003，11（7）：57-59.

[4]高麗華，姜海英.清咽湯治療急性咽喉炎[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11（7）：650.

[5]林成軍，邢儒伶，張青.金黃消炎散治療口腔潰瘍[J].江蘇中醫(yī)藥，1998，19（8）：36-38.

[6]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊(cè)）[M].上海：上海人民出版社，1985：1139-1140.

[7]張煜，王彥峰.廣西常用中草藥、壯藥抗幽門螺桿菌作用的篩選研究[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2008（10）：19-20，44.

[8]華娟，周明康，周瓊珍，等.50種傳統(tǒng)熱解毒藥的抑菌實(shí)驗(yàn)[J].中藥材，1995，18（5）：255-258.

[9]左風(fēng).心葉青牛膽根提取物對(duì)四氧嘧啶糖尿病大鼠的抗氧化作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)（中醫(yī)中藥分冊(cè)），2002，24（2）：105.

[10]Mathew S，KuttanG.Immunomodulatory and antitumour activities of Tinospora cordifolia[J].Fitoterapia，1999，70（1）：35-43.

[11]胡建英，心葉青牛膽可改變小鼠經(jīng)γ射線照射后的死亡率[J].國(guó)外醫(yī)藥（植物藥分冊(cè)），2005，20（1）：31.

[12]王維亭.波心青牛膽中cycloneucalenol與cycleucalenone對(duì)心臟收縮的影響[J].國(guó)外醫(yī)藥（植物藥分冊(cè)），2004，19（2）：73-74.

[13]王小箐，李玲.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：36.

[14]葛曉改，陳芳，陸斌，等.大黃藤莖尖快繁研究[J].北方園藝，2009（1）：53-57.

[15]陳加利，楊琪，林海葉，等.寬筋藤組織培養(yǎng)的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（10）：219-224.

[16]吉訓(xùn)志，秦曉威，胡麗松，等.木本植物組織培養(yǎng)[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019（39）：33-36.

（責(zé)編：徐世紅）