胃癌組織中CSN6的表達(dá)及臨床意義

卓長(zhǎng)華，阮 強(qiáng)，林瑞榕，張和軍，楊春康

(1.福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤外科，福建 福州 350014；2.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院生物與醫(yī)藥專(zhuān)業(yè)2020級(jí)，福建 福州 350108；3.福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，福建 福州 350014)

胃癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第四位，死亡率僅次于肺癌[1]。我國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū)，由于早期胃癌缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，且我國(guó)胃鏡篩查尚未普及，約50%～70%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)處于中晚期[2]。近年來(lái)，盡管外科及輔助治療取得重大進(jìn)展，但胃癌惡性度高，切除后仍易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。明確侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)提高早期診斷、開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)藥物具有重要意義。

組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體亞基(Constitutive photomorphogenesis 9 signalosome,CSN)是動(dòng)植物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的多亞基蛋白復(fù)合體，與26S蛋白酶體的19S“蓋子”亞復(fù)合體同源，是泛素-蛋白酶體通路的調(diào)節(jié)因子。CSN由8個(gè)亞基(CSN1-CSN8)組成，在多種真核生物中對(duì)蛋白質(zhì)降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期具有重要意義[3]。CSN6是CSN的亞基之一，在多種腫瘤中表達(dá)異常增高，并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[4]。目前CSN6與胃癌的關(guān)系尚未明確，本研究探討CSN6在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如上。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2019年11月～2020年2月我院手術(shù)切除的30例新鮮胃癌及癌旁組織，采用Western blot法對(duì)CSN6蛋白進(jìn)行定量分析。選取2014年1月～2015年9月我院病理科存檔的170例胃癌組織及癌旁正常石蠟組織，所有患者均行根治性切除手術(shù)，采用免疫組化對(duì)CSN6蛋白進(jìn)行定性分析。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2主要試劑：CSN6兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，二抗及DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，Western blot試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：Western blot法定量檢測(cè)CSN6蛋白的表達(dá) 將新鮮的胃癌及癌旁組織研碎加入RIPA細(xì)胞溶解液提取蛋白，低溫高速離心提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將等量的總蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(稀釋比1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。以GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件對(duì)條帶灰度值掃描分析，對(duì)蛋白進(jìn)行半定量分析。

免疫組化法定性檢測(cè)CSN6蛋白的表達(dá) 將石蠟標(biāo)本以4 μm切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精再水合，枸櫞酸鈉溶液高溫修復(fù)抗原，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，加入一抗(稀釋比1∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。結(jié)果判讀：CSN6主要定位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分；兩項(xiàng)得分相加：<3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1CSN6蛋白在胃癌新鮮組織中的表達(dá)情況：新鮮胃癌組織中CSN6的表達(dá)量為1.821±0.421，高于癌旁正常組織的0.976±0.311，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.326，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：1～3為胃癌組織，4～6為胃癌旁黏膜組織

2.2CSN6蛋白在胃癌石蠟組織中的表達(dá)情況：CSN6蛋白在胃癌及相應(yīng)癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為55.3%和28.8%(χ2=24.440，P<0.05)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2～3。胃癌中，CSN6的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位、身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index,BMI)、分化程度、神經(jīng)浸潤(rùn)、脈管癌栓、腫瘤大小、手術(shù)方式無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CSN6與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 CSN6在胃癌組織中表達(dá)表達(dá)陽(yáng)性(SP×400倍)

CSN6陽(yáng)性患者的5年生存率為41.6%，低于陰性患者的60.1%(χ2=10.310，P=0.001)，見(jiàn)圖4。單因素分析表明CSN6、分化程度、腫瘤大小、神經(jīng)浸潤(rùn)、脈管癌栓、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期與患者預(yù)后有關(guān)。多因素分析表明，CSN6、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 臨床病例特征與預(yù)后的關(guān)系

圖3 CSN6在癌旁正常組織中表達(dá)陰性(SP×400倍)

圖4 胃癌組織中CSN6表達(dá)陽(yáng)性、陰性患者生存曲線

3 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素、多階段的緩慢發(fā)展過(guò)程，其中基因突變及異常表達(dá)在腫瘤的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥等方面起著重要作用[5]。對(duì)于中晚期胃癌，單純手術(shù)切除療效往往欠佳。近年來(lái)，靶向治療成為胃癌治療的熱點(diǎn)，因此，需要進(jìn)一步探索新的分子生物指標(biāo)用于監(jiān)測(cè)胃癌預(yù)后和治療。

CSN是進(jìn)化保守的多蛋白復(fù)合體，存在于所有真核生物中。CSN通過(guò)調(diào)節(jié)泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起重要作用，如細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活和腫瘤發(fā)生。在CSN亞基中，CSN6含有MPN(Mpr1p和Pad1p N-終端)結(jié)構(gòu)域的亞基,對(duì)調(diào)節(jié)依賴(lài)MPN末端結(jié)構(gòu)域的蛋白酶體相關(guān)活性起至關(guān)重要的作用[6]。CSN6在人類(lèi)多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，在上尿路上皮癌患者中，CSN6陽(yáng)性患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率高于陰性患者，生存時(shí)間比陰性患者低[7]。胰腺癌中，CSN6的表達(dá)和血清糖類(lèi)抗原19-9表達(dá)水平呈正相關(guān)，CSN6高表達(dá)的患者總生存期較短[8]。CSN6可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[9]。CSN6在口腔鱗癌細(xì)胞系和組織中均顯著上調(diào)，與淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。然而CSN6在胃癌組織中的表達(dá)尚未研究。

本研究中，無(wú)論是定量還是定性分析，胃癌組織中CSN6的表達(dá)比癌旁組織增多，說(shuō)明CSN6參與胃癌的發(fā)生。胃癌的浸潤(rùn)深度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、病理分期越高，CSN6的陽(yáng)性率越高，表明CSN6參與胃癌的進(jìn)展。CSN6陽(yáng)性患者的5年生存率低于陰性患者，是判斷胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，建議術(shù)后胃癌標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)免疫組化檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性患者進(jìn)行更積極的輔助治療及復(fù)查。

CSN6致癌的作用機(jī)制尚未完全統(tǒng)一，目前可能的原因?yàn)椋篜53激活后參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期凋亡，超過(guò)50%的人類(lèi)惡性腫瘤與p53功能缺失、突變有關(guān)。E3泛素蛋白連接酶(MDM2)，在細(xì)胞遷移、DNA修復(fù)和細(xì)胞信號(hào)傳遞等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是p53抑癌基因的重要負(fù)調(diào)控因子。CSN6中的MPN結(jié)構(gòu)域與MDM2癌蛋白直接相互作用，引起p53抑癌基因的功能受到抑制，因此，CSN6被認(rèn)為會(huì)直接促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[11]。CSN6過(guò)表達(dá)導(dǎo)致14-3-3σ表達(dá)下調(diào)，從而激活A(yù)kt，促進(jìn)細(xì)胞存活。此外，CDK抑制劑P57具有調(diào)控細(xì)胞分裂周期以避免細(xì)胞過(guò)度分裂作用，CSN6是p57的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，CSN6的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞中p57表達(dá)降低，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂[12]。

本研究不足之處，樣本量相對(duì)較小，且為單中心進(jìn)行回顧性研究。并未檢測(cè)血清CSN6的表達(dá)情況，無(wú)法判斷血清中CSN6的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

總之，CSN6在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，是判斷腫瘤預(yù)后的重要分子生物，同時(shí)也是防治胃癌的潛在靶點(diǎn)。