吡非尼酮對(duì)新西蘭兔膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕攣縮的改善作用

張永光，盛青松，邱 卓，胡建偉，陳建梅，葉永平

瘢痕是機(jī)體在創(chuàng)傷后組織修復(fù)過(guò)程中的必然產(chǎn)物[1]。由于全身或局部多種因素的影響，瘢痕組織往往過(guò)度增生而具有較強(qiáng)的收縮性，可使肢體的正常解剖結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙等[2]。創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)囊周?chē)：壅尺B及攣縮是膝關(guān)節(jié)屈伸功能受限的重要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。對(duì)于涉及濱海及遠(yuǎn)洋作業(yè)人群，膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后因高滲海水浸泡及難以及時(shí)救治等多重因素，瘢痕攣縮所致功能受限更為明顯，致畸致殘率更高。因此，海水浸泡膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕攣縮是亟待解決的臨床難題[4]。目前。此類(lèi)研究尚少見(jiàn)于報(bào)道。

吡非尼酮(Pirfenidone，PFN)是一種具有抗炎、抗氧化和抗纖維化作用的新型小分子化合物，對(duì)于特發(fā)性肺纖維化具有良好的療效[5]。然而，關(guān)于吡非尼酮治療膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕攣縮卻未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探索通過(guò)口服吡非尼酮改善海水浸泡動(dòng)物膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性瘢痕，觀察其對(duì)增生性瘢痕的影響，通過(guò)組織Masson染色和標(biāo)本ELISA檢測(cè)進(jìn)一步觀察其治療效果，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 吡非尼酮(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，速眠新與蘇醒珍(長(zhǎng)沙拜特生物科技研究所)，多聚甲醛(國(guó)際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，兔羥脯氨酸(Hyp)ELISA試劑盒(酶免，MM-36861O2)，蘇木精染色液(Solarbio)，伊紅染色液(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，無(wú)水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)，二甲苯(西隴科學(xué)股份有限公司)，中性樹(shù)膠(biosharp)，小鼠/兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(SA1020，BOETER)，DAB顯色試劑盒(AR1022，BOETER)，Masson染色三色試劑盒(G1340，SoLarBio)，TGF-β1(21898-1-AP，Proteintech)，KH-TS型自動(dòng)組織脫水機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)，KH-BL型包埋機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)，KH-BL型包埋機(jī)冷臺(tái)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(賽默飛世爾儀器有限公司)，攤片烤片機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)，黏附載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)，超純水機(jī)(Millipore 超純水機(jī))。

1.2 動(dòng)物分組與手術(shù) 普通級(jí)雄性新西蘭兔20只(約2.2 kg，上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，許可證號(hào)碼：SCXK[滬]2017-0008)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，規(guī)律喂食、飲水。按照隨機(jī)數(shù)字表法將新西蘭兔分為四組：生理鹽水組(NS組)，無(wú)菌海水組(SW組)，生理鹽水+ PFD治療組(NS+PFN)，無(wú)菌海水+PFD治療組(SW+PFN)，每組5只。膝關(guān)節(jié)手術(shù)過(guò)程如下：選取兔子右側(cè)大腿肌肉注射速眠新(0.1～0.2 ml/kg)麻醉。進(jìn)入手術(shù)麻醉狀態(tài)后，用剃毛器去除左腿膝關(guān)節(jié)周?chē)拿?，將兔子固定在小?dòng)物手術(shù)臺(tái)上，75%乙醇、碘伏消毒術(shù)野；無(wú)菌刀片沿髕旁內(nèi)側(cè)縱行做長(zhǎng)4 cm的膝關(guān)節(jié)切割傷口，逐層切開(kāi)至關(guān)節(jié)腔，暴露關(guān)節(jié)軟骨面，傷后患肢無(wú)菌紗布?jí)浩戎寡⑼孟リP(guān)節(jié)創(chuàng)口于無(wú)菌生理鹽水/無(wú)菌海水中浸泡1 h，浸泡結(jié)束后給予生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，依次縫合創(chuàng)口，無(wú)菌紗布包扎。給予兔子右大腿注射0.2 ml蘇醒珍，待兔子蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。吡非尼酮治療組(NS+PFN組和SW+PFN組)動(dòng)物予吡非尼酮(0.75 g)與飼料混合喂養(yǎng)，每天給藥1次。NS組和SW組僅給予飼料喂養(yǎng)。術(shù)后4周深度麻醉動(dòng)物后取材。將關(guān)節(jié)液保存于-80 ℃冰箱；髕上囊與關(guān)節(jié)周?chē)：劢M織用4%多聚甲醛固定液固定后保存于室溫。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理并經(jīng)由第九〇〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.3 Masson染色 用配制好的weigert鐵蘇木精染色液染色7 min。酸性乙醇分化液分化10 s，水洗。Masson藍(lán)化液返藍(lán)3 min，水洗。蒸餾水洗1 min。麗春紅品紅染色液染色30 s。在上述操作過(guò)程中按蒸餾水：弱酸溶液=2∶1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min。磷鉬酸溶液洗2 min。用配置好的弱酸工作液洗1 min。使用苯胺藍(lán)染色液滴加1 min。用配置好的弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脫水。無(wú)水乙醇脫水3次，每次15 s。二甲苯透明10 min。中性樹(shù)膠封片。

1.4 羥脯氨酸含量檢測(cè) 從室溫平衡 20 min 后的鋁箔袋中取出所需樣本。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；樣本孔中加入待測(cè)樣本 50 μl；空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μl)，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min。 每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.5 TGF-β1含量檢測(cè) 將獲取的新鮮標(biāo)本加入磷酸緩沖鹽溶液，勻漿充分，離心，收集上清液。稀釋后各孔加樣量50 μl。加樣時(shí)設(shè)空白孔與樣品孔。樣品孔中先加入40 μl樣品稀釋液，然后加入10 μl待測(cè)樣品。加樣過(guò)程中，注意將樣品加于酶標(biāo)板孔的底部，不觸及酶標(biāo)板孔的孔壁，搖晃混勻。加酶，除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑溶液 50 μl，空白孔不加酶。封板后將酶標(biāo)包被板放入 37 ℃溫箱中溫育30 min。使用蒸餾水將30倍濃縮洗滌液稀釋30倍后備用。從溫箱中取出酶標(biāo)包被板，去除封膜，棄去液體，甩干，然后使用洗滌液將每孔加滿，靜置 30 s后棄去，此步驟重復(fù)5次，最后拍干。每孔加入顯色劑 A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，搖晃混勻后放入避光處顯色10 min，溫度保持在 37 ℃。 酶標(biāo)包被板上的每孔加入終止液50 μl，結(jié)束反應(yīng)過(guò)程。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的OD值。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 術(shù)后以絲線縫合切口，各組動(dòng)物切口3 d左右干燥結(jié)痂，無(wú)明顯滲出，切口周?chē)つw無(wú)紅腫。1周左右線結(jié)脫落，愈合良好，切口無(wú)裂開(kāi)、潰瘍、感染等情況。

2.2 Masson染色結(jié)果 如圖1所示，在NS組和SW組，膠原纖維粗大，呈螺旋狀排列，結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為致密而紊亂狀；在吡非尼酮處理組(NS+PFN組和SW+PFN組)，膠原纖維分布相對(duì)稀疏，大致呈平行排列，相對(duì)更為規(guī)則。

圖1 瘢痕組織Masson染色結(jié)果(×100)

2.3 羥脯氨酸水平 檢測(cè)結(jié)果顯示，在SW組、NS組、SW+PFN組和NS+PFN組，羥脯氨酸分別為(114.20±14.54)ng/ml、(99.21±18.27)ng/ml、(87.91±12.02)ng/ml和(76.17±18.72)ng/ml，水平逐漸降低。SW+PFN組羥脯氨酸水平明顯低于SW組(P<0.05)。

2.4 TGF-β1水平 檢測(cè)結(jié)果顯示，SW組和NS組TGF-β1水平分別為(151.53±20.21)ng/ml和(141.72±4.14)ng/ml。經(jīng)吡非尼酮干預(yù)后，SW+PFN組和NS+PFN組TGF-β1水平相對(duì)降低，分別為(106.53±12.86)ng/ml和(92.03±10.05)ng/ml。SW+PFN組TGF-β1水平明顯低于SW組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

膝關(guān)節(jié)是人體最大的關(guān)節(jié)，負(fù)重多且運(yùn)動(dòng)量大[6]。由于膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)面大且部位表淺，杠桿作用最強(qiáng)，不穩(wěn)定而易受傷。膝關(guān)節(jié)損傷后，出現(xiàn)功能障礙的一個(gè)主要原因在于關(guān)節(jié)囊周?chē)M織的瘢痕粘連及攣縮，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)屈伸功能受限[7]。嚴(yán)重的膝關(guān)節(jié)瘢痕攣縮會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)功能喪失，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[8]。濱海地區(qū)涉海及遠(yuǎn)洋作業(yè)人群龐大，膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后因高滲海水浸泡及難以及時(shí)救治等多重因素，膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷更為嚴(yán)重，后期瘢痕攣縮致功能受限更為明顯，導(dǎo)致患者致畸致殘率更高。此外，沿海部隊(duì)渡海登島演練亦存在膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷海水浸泡、瘢痕攣縮致畸致殘等情況[9, 10]。故此，解決膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后周?chē)：蹎?wèn)題，探索一條治療海水浸泡膝關(guān)節(jié)損傷的行之有效的方法，具有重要的臨床實(shí)踐意義。

瘢痕是人體在創(chuàng)傷后組織修復(fù)過(guò)程中的必然產(chǎn)物，任何創(chuàng)傷的愈合均伴有不同程度的瘢痕形成[11]。在組織修復(fù)過(guò)程中，由于全身或局部多種因素的影響，常出現(xiàn)瘢痕組織的過(guò)度增生而形成增生性瘢痕。增生性瘢痕具有較強(qiáng)的收縮性，可使膝關(guān)節(jié)的正常解剖結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[12]。增生性瘢痕的形成往往是多因素共同作用的結(jié)果。一般認(rèn)為成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原合成與降解失衡在瘢痕形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。此外，機(jī)體受損后，成纖維細(xì)胞激活、增殖，轉(zhuǎn)化成表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞，分泌產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)。

在肌成纖維細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子中，研究較多的是 TGF-β1，它是目前已知的與增生性瘢痕形成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子[14]。TGF-β1的主要生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和結(jié)締組織的合成。在成纖維細(xì)胞中，TGF-β1刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成與沉積，抑制膠原酶的產(chǎn)生，并能增加膠原酶抑制劑的產(chǎn)生。TGF-β1除能導(dǎo)致組織纖維化，也能誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞高表達(dá) α-SMA[15]。也就是說(shuō)修復(fù)細(xì)胞中成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原合成與降解失衡，部分生長(zhǎng)因子的大量產(chǎn)生及三者之間相互協(xié)調(diào)的關(guān)系構(gòu)成了增生性瘢痕形成的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解、抑制膠原的合成和 TGF-β1的過(guò)表達(dá)對(duì)于治療增生性瘢痕來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

在本研究中，我們將吡非尼酮應(yīng)用于海水浸泡后的膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中。通過(guò)組織學(xué)觀察和免疫學(xué)測(cè)定，結(jié)果表明吡非尼酮抑制了海水浸泡后膝關(guān)節(jié)傷口愈合過(guò)程中的膠原合成，緩解了瘢痕粘連。膝關(guān)節(jié)損傷經(jīng)海水浸泡后，在對(duì)照組，膠原纖維粗大，呈螺旋狀排列，結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為致密而紊亂狀；在吡非尼酮處理組，膠原纖維稀疏而排列相對(duì)規(guī)則，大致平行。膠原是瘢痕組織的重要組成部分，主要由成纖維細(xì)胞合成和分泌。羥脯氨酸是膠原蛋白的主要組成氨基酸，占膠原纖維氨基酸含量的12.5%，其含量測(cè)定可以反映瘢痕組織中膠原的形成。ELISA測(cè)定結(jié)果表明，SW+PFN組羥脯氨酸水平明顯低于SW組，表明吡非尼酮可能抑制了創(chuàng)傷后膠原蛋白的合成，從而緩解了創(chuàng)傷后瘢痕的過(guò)度增生。TGF-β1是肌成纖維細(xì)胞分泌的與瘢痕過(guò)度形成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子。吡非尼酮屬于細(xì)胞因子抑制藥，在臨床上已經(jīng)成為治療特發(fā)性肺纖維化的一線藥物。吡非尼酮通過(guò)抑制TGF-β1，一定程度上控制了成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，減少細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白的沉積，從而達(dá)到延緩患者肺纖維化程度[16]。在本研究中，SW+PFN組TGF-β1水平顯著低于SW組，提示吡非尼酮可能通過(guò)抑制TGF-β1水平，從而降低了成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，最終抑制了瘢痕的過(guò)度增生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，吡非尼酮能有效地抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海水浸泡膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕增生，且可能是通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)，從而調(diào)控了膠原合成與降解，緩解了瘢痕的過(guò)度增生。因此，吡非尼酮可能成為治療海水浸泡膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的藥物，具有一定的應(yīng)用潛力。然而，本實(shí)驗(yàn)仍存在一些不足之處。首先，海水具有低溫、偏堿性、高滲透壓及致病菌多等特點(diǎn)[17]，傷口繼發(fā)的病理生理學(xué)變化往往比陸地?fù)p傷更為復(fù)雜，難于控制，本實(shí)驗(yàn)尚屬初步探索，真實(shí)海水浸泡環(huán)境的模擬和重現(xiàn)在進(jìn)一步研究中尤為重要。其次，目前學(xué)者們大多采用兔制備膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后粘連動(dòng)物模型[18]，側(cè)重于術(shù)后并發(fā)癥的治療；海水浸泡膝關(guān)節(jié)損傷少見(jiàn)于報(bào)道，診斷標(biāo)準(zhǔn)仍不明確，加之致傷混雜因素繁多，至今并無(wú)公認(rèn)成熟的海水浸泡膝關(guān)節(jié)損傷動(dòng)物模型供研究使用。因此，需要不斷深入研究來(lái)獲取更完善的數(shù)據(jù)指標(biāo)，從而建立適宜的動(dòng)物損傷模型以利于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。