丹參酮ⅡA對(duì)小鼠肺爆震傷導(dǎo)致的腦損傷的保護(hù)作用

施 琳，佟昌慈，叢培芳，柳云恩

在恐怖事件中，肺、胃腸道和腦是最容易受沖擊波損傷的部位，其中肺沖擊傷是最有可能造成嚴(yán)重傷亡的原因[1]。經(jīng)歷爆炸的受害者雖未出現(xiàn)明顯的腦部損傷，但至少一半以上的傷員出現(xiàn)失眠、眩暈和記憶力減退等癥狀。腦損傷是一種復(fù)雜的級(jí)連反應(yīng)，包括腦缺血后炎性反應(yīng)、線粒體損傷、產(chǎn)生氧化自由基等[2]。目前，由于尚無(wú)有效的治療方法，因此，研究爆震傷的損傷過(guò)程及機(jī)制十分重要。

炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激在腦損傷的病理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。研究證明多種細(xì)胞在腦損傷后，過(guò)度激活NF-κB，導(dǎo)致多種基因如促炎因子、轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)基因的高表達(dá)，從而加重炎性反應(yīng)及腦損傷[3]。紅景天苷通過(guò)激活PI3K/Akt通路改善腦缺血損傷[4]。芒果苷通過(guò)降低氧化應(yīng)激和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)異氟醚對(duì)新生兒缺氧性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。丹參酮ⅡA(Tan ⅡA)是一種中草藥，具有廣泛的抗炎性反應(yīng)、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡和抗腫瘤活性，因此Tan ⅡA被廣泛用于治療心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腸道疾病、過(guò)敏性疾病、糖尿病和各種腫瘤[6]。前期研究成果證明，Tan ⅡA可抑制肺爆震傷誘導(dǎo)的肺組織損傷，降低沖擊波誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[7，8]，而肺爆震傷可誘導(dǎo)腦損傷[9]，因此推測(cè)Tan ⅡA同樣可以在肺爆震致腦損傷的過(guò)程中起保護(hù)作用。然而，Tan ⅡA是否能改善肺爆震致腦損傷小鼠的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，以及Tan ⅡA的保護(hù)作用是否與PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)尚不清楚。本研究通過(guò)肺爆震致腦損傷小鼠模型，探討TanⅡA調(diào)控腦損傷的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 30只健康雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自本溪長(zhǎng)生生物科技有限公司。丹參酮ⅡA和二氫乙啶(dihydroethidium, DHE)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。Tau、S100β、IL-1β、TNF-α、IL-10、MDA5、IRE- α、SOD-1以及PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 采用自主設(shè)計(jì)研發(fā)的高仿真爆震傷模擬裝置，建立肺爆震傷致小鼠腦損傷模型。采用空氣壓縮到一定程度沖破鋁膜產(chǎn)生的沖擊波作用小鼠胸部制備肺爆震傷致小鼠腦損傷模型。具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Sham)、爆震傷組(Blast)、爆震傷Tan ⅡA干預(yù)組(Tan ⅡA)。建模成功后給予Tan ⅡA干預(yù)。Sham組和Blast組小鼠腹腔注射10 mg/kg生理鹽水，1次/d；Tan ⅡA組小鼠腹腔注射5 mg/kg Tan ⅡA，1次/d，連續(xù)7 d。第7 天處死所有小鼠；收集腦組織標(biāo)本，左半腦凍存，全部用以后續(xù)勻漿提取總蛋白，檢測(cè)腦組織損傷、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)情況；右半腦甲醛固定，取材時(shí)用小鼠腦切片磨具(冠狀)暴露海馬區(qū)。采用HE染色，觀察小鼠腦組織病理學(xué)改變。

1.2.2 ROS檢測(cè) 石蠟切片脫蠟至水，二氫乙啶(dihydroethidium, DHE)10 μM避光孵育20 min，PBS中浸洗后，熒光顯微鏡鏡下觀察照相。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 采用Western blot技術(shù)，檢測(cè)腦損傷標(biāo)志物Tau和S100β、腦組織炎性相關(guān)因子IL-1β、TNF-α、和IL-10和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白MDA5 、IRE-α和SOD-1的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠腦組織病理改變比較 與Sham組相比，Blast組小鼠海馬區(qū)可見(jiàn)明顯的神經(jīng)元損傷及核固縮，同時(shí)腦血管周圍出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。TanⅡA組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷及核固縮明顯減輕，腦血管周圍出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況緩解(圖1)。

圖1 爆震傷小鼠腦組織病理改變

2.2 小鼠腦組織損傷標(biāo)記物的表達(dá)比較 與Sham組相比，Blast組小鼠腦損傷標(biāo)志物Tau和S100β蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Blast組相比，TanⅡA組小鼠Tau和S100β蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2，表1)。

圖2 爆震傷小鼠腦組織損傷相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表1 各組小鼠腦組織損傷蛋白的相對(duì)表達(dá)

2.3 小鼠腦組織炎癥損傷比較 與Sham組相比，Blast組小鼠炎性相關(guān)因子IL-1β和TNF-α蛋白明顯升高，IL-10蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Blast組相比，TanⅡA組小鼠IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)降低，IL-10蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3，表2)。

圖3 小鼠腦組織炎癥損傷蛋白的相對(duì)表達(dá)情況

表2 各組小鼠腦組織炎癥損傷蛋白的相對(duì)表達(dá)

2.4 小鼠腦組織氧自由基比較 與Sham組相比，Blast組小鼠ROS的產(chǎn)生增多；與Blast組相比，TanⅡA組氧自由基的產(chǎn)生明顯降低(圖4)。

2.5 小鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷比較 與Sham組相比，Blast組小鼠氧化應(yīng)激MDA5和IRE-α蛋白明顯升高，而SOD-1蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Blast組相比，TanⅡA組小鼠MDA5和IRE-a蛋白表達(dá)降低，SOD-1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5，表3)。

表3 各組小鼠腦組織氧化應(yīng)激蛋白的相對(duì)表達(dá)

2.6 小鼠腦組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表達(dá)比較 與Sham組相比，Blast組小鼠PI3K和Akt磷酸化水平及NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Blast組相比，TanⅡA組小鼠PI3K和Akt磷酸化水平及NF-κB蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6，表4)。

圖6 小鼠腦組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白的相對(duì)表達(dá)情況

表4 各組小鼠腦組織PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白的相對(duì)表達(dá)

3 討 論

本研究證明，肺爆震傷后腦組織發(fā)生海馬區(qū)神經(jīng)元損傷、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激的病理變化。結(jié)果表明，TanⅡA能顯著抑制肺爆震傷致腦損傷的病理學(xué)改變，減輕海馬區(qū)神經(jīng)元損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氧化應(yīng)激。此外，TanⅡA還能顯著降低p-PI3K、p-Akt和NF-κB的表達(dá)。這些結(jié)果為T(mén)anⅡA減輕肺爆震傷致腦損傷提供了證據(jù)，這種作用可能部分通過(guò)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路起作用。

TanⅡA是從唇形科植物丹參的根中提取分離的脂溶性菲醌化合物，為中藥丹參中的有效成分，近年來(lái)通過(guò)對(duì)丹參酮ⅡA大量的藥理和臨床研究中發(fā)現(xiàn)，其具有抗血小板聚集、抗血栓及較強(qiáng)的抗菌活性、抗炎、抗凋亡作用[6]。TanⅡA通過(guò)增加冠狀動(dòng)脈流量，增加心肌供氧，保護(hù)ATP酶活性，糾正心肌細(xì)胞內(nèi)異常的鈣代謝，減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，從而對(duì)心肌起到保護(hù)作用[11]；亦可抑制腦組織COX-2的過(guò)度表達(dá)和膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制炎性反應(yīng)，改善神經(jīng)功能學(xué)癥狀，對(duì)局灶性腦缺血和缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[12]。另外，TanⅡA通過(guò)ERK和GSK-3β信號(hào)通路抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元減少，具有神經(jīng)保護(hù)作用和改善學(xué)習(xí)記憶能力[13]。TanⅡA通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激激活，減輕神經(jīng)元凋亡，改善學(xué)習(xí)記憶[14]。TanⅡA可通過(guò)改善淀粉樣前體蛋白的非淀粉樣降解，減少p-tau和淀粉樣β1-42(Aβ1-42)的蓄積等，減輕AD的病理癥狀[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，TanⅡA可顯著減輕腦組織損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氧化應(yīng)激，提示TanⅡA能減輕沖擊傷所致的腦組織損傷、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

研究發(fā)現(xiàn)，Aggf1通過(guò)PI3K/Akt/NF-κB途徑減輕大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后的神經(jīng)炎癥和BBB破壞[16]。PI3k/Akt/NF-κB通路上調(diào)可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，導(dǎo)致情緒行為和認(rèn)知功能障礙[17]。GRP78通過(guò)PI3K/Akt、ERK1/2和NF-κB/p65途徑促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞抗凋亡和存活[18]。異丙酚通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血誘導(dǎo)的早期腦損傷[19]。說(shuō)明PI3K/Akt/NF-κB通路參與腦組織損傷的調(diào)控。丹參酮ⅡA和黃芪甲苷IV通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)和抑制TRL4/NF-κB信號(hào)來(lái)減輕ApoE沉默小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脆弱性[20]。丹參莖葉總酚酸聯(lián)合丹參酮通過(guò)抑制TLR4/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎起保護(hù)作用[21]。TanⅡA通過(guò)下調(diào)Kupffer細(xì)胞中HMGB1-TLR-4/NF-κb通路和PTEN/PI3K/AKT通路的激活，減輕肝移植引起的缺血再灌注損傷[22]。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，TanⅡA可有效抑制肺爆震傷誘導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB通路，發(fā)揮腦保護(hù)作用。結(jié)果表明，TanⅡA對(duì)肺爆震傷致腦損傷小鼠的保護(hù)作用可能與PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)。

綜上所述，TanⅡA能抑制肺爆震傷誘導(dǎo)PI3K/Akt/NF-κB通路的激活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，TanⅡA靶向PI3K/Akt/NF-κB可能在神經(jīng)保護(hù)方面具有獨(dú)特的藥理學(xué)潛力，是一種很有前途的藥物。