利用濁度法快速測定磷酸三鈉對兩種采后病原真菌的MIC及NIC值

劉瑤瑤 ，孫楊瑩，陳遠志，羅 錦，趙子嘉 ，周 婷

(1. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術研究杭州市重點實驗室，浙江 杭州 311121; 2. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院植物RNA信號傳導中心，浙江 杭州 311121)

0 引言

水果產(chǎn)業(yè)包括種植、采摘、加工、貯藏、運輸、銷售等多個環(huán)節(jié).我國對產(chǎn)前栽培管理階段重視程度較高，但水果含水量高、容易腐爛，且成熟期相對集中，生產(chǎn)地多遠離銷售地，因此對貯藏條件和運輸周期有較高要求.目前，我國水果貯存能力僅占總產(chǎn)量的20%，且大多為簡易貯藏，70%以上鮮果幾乎不經(jīng)過任何加工即進入市場流通環(huán)節(jié).由于采后管理不善、包裝處理不當以及缺乏完整的冷鏈運輸銷售系統(tǒng)，新鮮水果的采后損失率高達20%～25%.鮮果在采后流通過程中造成經(jīng)濟損失的主要原因可歸納為以下幾種：生理(果蔬自身生理衰敗)、病理(病原微生物致腐)、物理(機械損傷、環(huán)境參數(shù)不適)以及多因素協(xié)同作用，但最終直觀損失大多為病理性腐爛損失.真菌是鮮果最主要的致腐性病原菌，在100萬種真菌中，大約有10%可導致采后病害.很多果實在采前就已被這些病害侵染，在貯藏或運輸期間發(fā)病，并通過水、空氣和土壤等媒介進行傳播，進而造成更大的損失.導致水果病害發(fā)生的主要病原真菌包括引起柑橘、蘋果腐爛的青霉菌(Penicilliumsp.)，引起梨、蘋果黑腐病的鏈格孢菌(Alternariasp.)，引起草莓和葡萄灰霉病的葡萄孢菌(Botrytissp.)，引起木瓜、芒果、香蕉炭疽病的炭疽菌(Colletotrichumsp.)以及番茄褐腐病的疫霉菌(Phytophtharasp.)等[1].

其中，Penicilliumexpansum俗稱擴展青霉，是半知菌的一種，也是最重要的采后病害之一.P.expansum孢子的抗逆性強，耐低溫，能夠長時間保持活性，一旦環(huán)境適宜，就能夠通過各種途徑進行擴散，通過機械損傷、壞死組織、昆蟲傷害、開放性花萼管甚至皮孔對宿主進行侵染，侵染處組織出現(xiàn)軟化、水化，并可觀察到明顯的白色菌絲及大量的藍綠色孢子，同時產(chǎn)生強烈的土腥味.P.expansum的宿主包括梨、蘋果、枇杷、山楂、桃、葡萄、櫻桃、番茄、柑橘、冬棗等多種水果[2]，幾乎涵蓋浙江省水果主要栽培品種.此外，P.expansum還能分泌對人體具有致癌、致畸作用的真菌毒素patulin，阻礙果實衍生產(chǎn)品后續(xù)加工[3]，嚴重危害我國水果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.鏈格孢霉(Alternariaalternata)在自然界中極為常見，包括分布于土壤污水中的腐生菌、動植物的內(nèi)生菌、植物的病原菌以及人和動物的條件致病菌.A.alternata可侵染多種農(nóng)作物，引起的病害可造成嚴重的經(jīng)濟損失[4].蘋果生產(chǎn)過程中易受到多種病害的危害，A.alternata是其中最主要的一種，能侵染蘋果葉片引起葉片黑斑病和落葉病，同時在蘋果植株中定殖，在花期侵染花朵從而導致后期果實患霉心病，在田間和儲藏期都可引起嚴重的經(jīng)濟損失.A.alternata還會產(chǎn)生寄主選擇性毒素，不僅引發(fā)植物病害，對人體及動物的健康也造成一定危害，具有致畸、致癌、致突變等作用[4].

目前，上述兩種采后病原菌的防治主要包括人工合成殺菌劑、天然抑菌物質(zhì)、生物防治等.人工合成殺菌劑是控制上述兩種采后病原菌最主要的方法，但過量使用會污染環(huán)境并導致抗性菌株產(chǎn)生[5-7]，因此尋找低毒、高效、環(huán)保的殺菌劑替代品尤為迫切.近年來，“公認安全化合物”(GRAS)及天然植物成分因具有良好的抑制真菌作用而被廣泛關注.磷酸鹽就是眾多成員中的一種，其中磷酸三鈉(trisodium phosphate，TSP)還具有殺菌作用.磷作為人類日常需要攝入的基礎營養(yǎng)物質(zhì)，其電離產(chǎn)生的Na+和PO3-也是生物體的組成成分，正常情況下并不會對人體健康造成不利影響.隨著對果蔬防治的日益重視，許多能夠用于果蔬采后病害的化學物質(zhì)慢慢被人們認知.TSP被證明對農(nóng)作物具有增產(chǎn)抗病功效，是一種新型環(huán)保的化學制劑.在我國，西紅柿、辣椒、黃瓜、大白菜等蔬菜種子浸種后，再用10%TSP溶液浸泡10～30 min，最后清水洗凈后催芽播種，可殺死種子表面或內(nèi)部的病原菌，減輕作物花葉病毒病.日本也采用以10%TSP溶液浸泡番茄、西瓜、葫蘆等種子10～25 min的消毒方法來防治蔬菜病毒性病害.因此，在實際應用中，TSP被認為是安全的、環(huán)境友好的食品添加劑.雖然目前TSP在國內(nèi)外已經(jīng)廣泛應用到植物病蟲害防治及植物營養(yǎng)領域，但國內(nèi)相關研究較為落后，其量化模型還有待完善，市場上也缺乏相關產(chǎn)品[8].

本文在明確TSP對P.expansum及A.alternata具有抑制作用的基礎上，通過濁度法測定TSP處理后兩種病原真菌的生長速度、孢子萌發(fā)時間，并結(jié)合Gompertz模型分別計算TSP對兩種真菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和非抑菌濃度(non-inhibitory concentration,NIC)值.該方法有潛力應用于快速測定不同抑菌物質(zhì)對不同病原真菌的MIC及NIC值，有助于進一步評估食品保質(zhì)期，從而確保食品質(zhì)量安全以及消費者健康.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用病原菌Penicilliumexpansum與Alternariaalternata分離自自然發(fā)病的蘋果(MalusdomesticaBorkh. cv. Red Fuji)，已經(jīng)過形態(tài)學觀察及rDNA-ITS法鑒定，保存于杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院食品生物化學實驗室.磷酸三鈉、吐溫20(Tween-20)購自美國Sigma公司，無菌96微孔板購自美國康寧Corning-Costar公司，其他主要試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司.蘋果從杭州市下沙寶龍廣場永輝超市采購.

1.2 培養(yǎng)基及病原真菌孢子懸浮液的制備

將馬鈴薯去皮切成小塊，稱取去皮馬鈴薯200 g，加水1 000 mL煮沸0.5 h后用雙層紗布過濾，濾渣棄去，向濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，不斷攪拌至完全溶解后加水補充至1 000 mL.將配制完成的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)分裝入500 mL三角瓶中，置于高壓滅菌鍋內(nèi)于121 ℃滅菌30 min后倒平板待用.

將病原菌P.expansum及A.alternata接種在PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d，用含有0.05% Tween-20的無菌水對孢子進行收集，經(jīng)過4層無菌紗布過濾后備用.將新鮮的P.expansum及A.alternata孢子懸浮液等量加入到含有100 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)的250 mL三角瓶中，取搖勻的孢子懸浮液少許置于潔凈的血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片后靜置3 min，在光學顯微鏡下統(tǒng)計計數(shù)區(qū)內(nèi)孢子數(shù)量，每個樣品重復3次，根據(jù)血球計數(shù)板使用說明計算孢子濃度，最終調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中孢子濃度為1.0×106spores·mL-1.

1.3 TSP對采后病原真菌P. expansum及A. alternata菌落擴展的抑制

分別將30 μL 1.0×106spores·mL-1的P.expansum及A.alternata孢子懸浮液用涂布棒均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，用打孔器獲取直徑為0.5 cm的菌餅，分別放置于含15 mL PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中央，培養(yǎng)基中含有1 mg·mL-1TSP，空白PDA也放置同樣的菌餅作為對照.分別在恒溫培養(yǎng)箱中于15、25 ℃培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑.15、25 ℃分別代表水果超市貨架貯藏溫度及常溫.

1.4 微孔板的準備及病原菌培養(yǎng)

分別將200 uL 105spores·mL-1的P.expansum及A.alternata孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至含20 mL酵母提取物的蔗糖半固體瓊脂(YES：酵母提取物8 g；蔗糖60 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；瓊脂0.488 g；蒸餾水)培養(yǎng)基中.孢子加入過程需要緩慢攪拌均勻并盡量避免氣泡產(chǎn)生.對于每種測試的真菌，準備兩個離心管，一個僅向YES中添加孢子懸浮液，另一個添加孢子懸浮液及4 000 mg·L-1TSP.在添加孢子之前將TSP先加入培養(yǎng)基中，避免改變瓊脂質(zhì)量濃度(1.22 mg·mL-1).

實驗中采用無菌96微孔板.首先在第1列至第12列的每個微孔中注入150 μL YES培養(yǎng)基.之后，將150 μL 4 000 mg· L-1的TSP分別注入微孔板第1列的每一個孔中.接著，采用8通道移液器分別吸取150 μL前一列的培養(yǎng)基至后一列直至第10列中.第11列微孔板中不加TSP作為抑菌劑對照組以定期取樣觀察真菌生長速度，最后一列注入等量的無菌水作為培養(yǎng)基空白組.得到的第1～11列微孔板中TSP的質(zhì)量濃度分別為4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90、0 mg ·L-1[9].

1.5 P. expansum及A. alternata生長速度測定，孢子萌發(fā)時間及MIC、NIC的計算

將每個平板在酶標儀中于25 ℃溫育30 min，600 nm下每隔30 min記錄一次吸光值，記錄時長取決于測試的真菌生長速度.每種真菌在特定的微孔板中生長，其中每橫排的12個孔分別代表含不同TSP濃度的P.expansum及A.alternata孢子懸浮液，每豎排的8個孔代表相同TSP濃度的8個重復，該實驗重復3次.此外，通過顯微鏡觀察進行真菌萌發(fā)研究，以評估初始OD增加時間與孢子萌發(fā)時間的相關性.培養(yǎng)3、6、9、12、15、20、25 h后從對照組中取出10 μL孢子，測定芽管長度.當50%以上的孢子芽管長度達到孢子最大直徑一半時，發(fā)芽時間被確定[10].

1.6 統(tǒng)計分析

對每組實驗的8次重復以及每種病原菌的3次生物學重復實驗均進行單因素方差分析，以確定實驗的可重復性.根據(jù)Tukey檢驗分析估算不同真菌的MIC和NIC值，所有數(shù)據(jù)分析均通過Statistica 7.1軟件(Statsoft Inc.，Tulsa，USA)進行處理[9].

2 結(jié)果與分析

2.1 TSP對采后病原真菌P. expansum及A. alternata菌落擴展的抑制

實驗結(jié)果(圖1A)表明，25 ℃下1 mg·mL-1TSP處理組與對照組P.expansum菌落病斑直徑均大于15 ℃下P.expansum病斑直徑； 15、25 ℃下處理組P.expansum菌落病斑直徑均明顯小于對照組.15 ℃下培養(yǎng)3 d，對照組P.expansum菌落直徑約為1.8 cm，而此時處理組菌落直徑僅約為1.2 cm；25 ℃下培養(yǎng)3 d，對照組P.expansum的菌落直徑約為2.1 cm，而此時處理組菌落直徑僅約為1.8 cm.15 ℃與25 ℃下分別培養(yǎng)4、5、6、7 d后，處理組P.expansum菌落直徑均小于對照組.綜上可見，1 mg·mL-1TSP處理對P.expansum菌落擴展有抑制作用.

注：誤差線代表3次獨立生物學重復實驗的平均標準偏差.

由圖1B可見，25 ℃下1 mg·mL-1TSP處理組與對照組A.alternata菌落病斑直徑均大于15 ℃下A.alternata病斑直徑；15、25 ℃下處理組A.alternata菌落病斑直徑均明顯小于對照組.15 ℃下培養(yǎng)3 d，對照組A.alternata菌落直徑約為1.4 cm，而此時處理組菌落直徑僅約為0.99 cm；25 ℃下培養(yǎng)3 d，對照組菌落直徑約為2.43 cm，而處理組菌落直徑僅約為1.31 cm.15 ℃與25 ℃下分別培養(yǎng)4、5、6、7 d后，處理組A.alternata菌落直徑均小于對照組.以上結(jié)果表明，1 mg·mL-1TSP處理對A.alternata菌落擴展有抑制作用.

2.2 P. expansum與A. alternata生長速度及孢子萌發(fā)時間

圖2與圖3分別表示未經(jīng)TSP處理的病原菌P.expansum與A.alternata孢子隨著培養(yǎng)時間延長，其培養(yǎng)基中吸光值OD600的變化(圖中OD600值均已減去培養(yǎng)基空白組產(chǎn)生的影響).

從圖中P.expansum與A.alternata的生長曲線拐點處可看出，P.expansum培養(yǎng)基中OD600的初始增加時間點大約是10 h，A.alternata初始增加時間點大約是8 h.這與通過測量芽管長度獲得的孢子萌發(fā)時間(P.expansum為10 h，A.alternata為8 h)結(jié)果一致.

2.3 TSP對P. expansum及A. alternata的MIC、NIC值

表1 兩種病原真菌隨ln[TSP]變化對應的積分面積

表2 模擬Gompertz方程后所得各參數(shù)值

表3 擬合Gompertz方程后得到的MIC、NIC值及擬合系數(shù)

由表3可知，兩種病原真菌P.expansum及A.alternata在TSP處理下的抑菌模型擬合系數(shù)R2分別為0.983和0.994，擬合線性準確度較高.由此可見，TSP對兩種病原真菌的抑制模型與Gompertz方程有較好的擬合度.與P.expansum相比，A.alternata的模型準確性更高.TSP對兩種病原真菌P.expansum和A.alternata的MIC值分別為854、2 434 mg· L-1，說明與A.alternata相比，P.expansum對TSP的敏感性更強.此外，食品處于實際環(huán)境中時，外界其他復雜因素和物質(zhì)對病原真菌生長的影響遠大于實驗室環(huán)境，由此可推斷該抑菌模型所推導得出的MIC、NIC值比實際食品環(huán)境中偏大.實驗所得的MIC與NIC值與國外其他研究者所計算的數(shù)值[13]非常接近.綜合以上實驗結(jié)果，利用濁度法測定以及Gompertz 方程擬合，可以快速而較準確地計算出TSP對兩種病原真菌P.expansum及A.alternata的MIC及NIC值.

3 討論

綜合以上實驗結(jié)果，TSP對Penicilliumexpansum及Alternariaalternata兩種病原真菌的生長有一定的抑制作用.我們通過濁度法確定了TSP處理下兩種病原真菌的孢子萌發(fā)時間、生長速度，擬合了TSP對兩種病原真菌的抑制模型，計算了TSP對P.expansum及A.alternata兩種病原真菌的MIC、NIC值.結(jié)果表明1 mg·mL-1TSP能夠在15 ℃以及25 ℃下對兩種病原真菌的菌落生長起到抑制作用，培養(yǎng)7 d后，處理組的菌落直徑明顯要小于對照組，未經(jīng)處理的兩種真菌孢子萌發(fā)時間穩(wěn)定在10 h與8 h，這與已經(jīng)報道的TSP對其他果蔬采后病原真菌的研究結(jié)果非常接近.此外，兩種病原真菌Gompertz方程的擬合重合度較高，線性相關性較好，計算所得的MIC與NIC值與國外研究者所報道結(jié)果接近，P.expansum對TSP的敏感性要高于A.alternata.

通過在PDA、YES培養(yǎng)基以及96微孔板中培養(yǎng)觀察和使用濁度法測定評估TSP對P.expansum及A.alternata兩種病原真菌的抑菌效果和敏感性的方法成本低廉且操作簡便，實驗效率高.此外，這種方法還可以用于同時快速篩選多種真菌及多種抗真菌物質(zhì)甚至不同濃度的相同抗真菌物質(zhì)，以便于建立正確的抑菌模型.但該方法若要有效應用，考慮到各個實驗室之間實驗設備以及實驗消耗品的差異，仍然需要進一步實驗來進行優(yōu)化完善與標準化.同時，該方法也存在一定缺點，若實驗過程中真菌開始發(fā)芽并且真菌菌絲開始分叉，尤其是在培養(yǎng)基表面形成團狀物，生成致密的菌絲體，會在一定程度上降低該實驗方法的準確性.但與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)皿測量的方法相比，該方法不論是在可行性上還是在簡便性上，都有較大的進步.

盡管研究者對TSP的抑菌機理尚不明確，但仍不可否認，TSP是一種低成本且無環(huán)境危害的抗真菌化合物，不僅可以與其他合成殺菌劑結(jié)合使用，還可以單獨作用于采后果蔬，對病原真菌進行綜合防治.在今后的研究中，還需要進一步探索TSP對多種病原真菌的具體抑制機制，發(fā)現(xiàn)并印證其作用模式，優(yōu)化改善TSP作為抑菌劑的使用效果與范圍.同時可利用全新的方法探索其他抗真菌化合物對采后病原真菌的抑制作用與敏感性研究，拓展采后果蔬病害防治思路，進一步保證食品質(zhì)量與安全.