miR-26a調(diào)控PTEN基因降低小鼠慢性淋巴白血病細(xì)胞的耐藥性

毛洪賓，何 明

(1.開封市人民醫(yī)院 臨床藥學(xué)科，河南 開封 475000； 2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床藥學(xué)科，河南 開封 475001)

慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是臨床常見的一種白血病，以外周血淋巴細(xì)胞增高及骨髓成熟淋巴細(xì)胞浸潤為主要特征[1]?；颊咴诨熯^程中對藥物的敏感性降低，繼而產(chǎn)生耐藥性，如何避免耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)是治療CLL的關(guān)鍵[2]。微小RNA(microRNA)參與多種生理病理過程，與腫瘤細(xì)胞的化療敏感性和耐藥性有關(guān)，miR-26a能夠調(diào)節(jié)化療藥物的敏感性[3]。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種抑癌基因，其表達(dá)降低是腎癌預(yù)后不良的有效指標(biāo)[4]。PTEN參與CLL細(xì)胞對氟達(dá)拉濱耐藥，且miR-26a可通過調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞生理病理過程，但兩者在CLL耐藥性中報道較少[5]。本研究通過觀察miR-26a調(diào)控PTEN對小鼠L1210細(xì)胞系和小鼠耐順鉑(cisplatin，DDP)L1210/DDP細(xì)胞亞系耐藥性的影響，探討其可能作用機制，旨在為臨床治療CLL提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：小鼠淋巴細(xì)胞白血病L1210細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。小鼠耐DDP淋巴細(xì)胞白血病L1210/DDP細(xì)胞亞系(上海奧陸生物科技有限公司)。

1.1.2 藥物、主要試劑：注射用DDP(山東齊魯制藥廠)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；MTT試劑(Sigma Aldrich公司)；pcDNA-miR-26a-inhibitor質(zhì)粒、pcDNA-miR-26a-inhibitor-NC質(zhì)粒(廣州銳博生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；野生型和突變型PTEN重組質(zhì)粒(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗小鼠PTEN、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase，AKT)多抗、p-AKT多抗和山羊抗兔IgG-HRP(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：將L1210細(xì)胞接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% FBS及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃常規(guī)培養(yǎng)；L1210/DDP細(xì)胞接種于DDP終濃度為0.1 mg/L的DMEM培養(yǎng)基，實驗前1周撤藥，取對數(shù)增殖期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

將細(xì)胞分為對照組(L1210細(xì)胞)、耐藥組(L1210/DDP細(xì)胞)、NC組(pcDNA-miR-26a-inhibits-NC質(zhì)粒+L1210/DDP細(xì)胞)和抑制劑組(pcDNA-miR-26a-inhibits質(zhì)粒+L1210/DDP細(xì)胞)。按照LipofectamineTM2000說明書將其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-26a、PTEN mRNA表達(dá)量：取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行PCR擴增。擴增條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。miR-26a上游引物：5′-AATC GAATTCGCTGAGTCAGA-3′；下游引物：5′-CATAAG GCGTCGAGTGCAACC-3′。U6上游引物：5′-ACTG CATGCCATTGCAGTC-3′；下游引物：5′-ACCGTG AACTTGCCTGCAA-3′。PTEN上游引物：5′-AGGT TCAGCTAGCTATGGCA-3′；下游引物：5′-CAGCCTA AACTGCTAGCTAA-3′。β-actin上游引物：5′-AGC AGCAGTTATACTAGCA-3′；下游引物：ACTAGCTAG CATCATGCAA-3′。miR-26a以U6為內(nèi)參，PTEN以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-26a、PTEN mRNA表達(dá)水平。

1.2.3 miR-26a與PTEN靶向性的檢測：預(yù)測miR-26a 3′UTR與PTEN之間的結(jié)合位點，分別構(gòu)建野生型重組質(zhì)粒pMir-PTEN-WT和突變型重組質(zhì)粒pMir-PTEN-MUT，分為野生型NC組、野生型+miR-26a組、突變型NC組、突變型+miR-26a組，利用LipofectamineTM2000將miR-26a-mimics/miR-26a-mimics-NC與pMir-PTEN-MT/pMir-PTEN-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染L1210細(xì)胞，按試劑盒說明書操作，計算相對熒光素酶活性。

1.2.4 耐藥性的檢測：取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，接種于96孔板，待細(xì)胞匯合至70%左右時，加入含DDP(0.02、0.2、2、20和200 g/mL)的DMEM培養(yǎng)基，48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL/孔，充分振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處吸光度(A)值，計算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，繪制細(xì)胞抑制率曲線，根據(jù)曲線擬合方程求出L1210細(xì)胞、L1210/DDP細(xì)胞對DDP的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhi-bitory concentration，IC50)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，PBS洗滌，2 500 r/min離心5 min，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻，4 ℃避光孵育15 min，10 μL PI染色5 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 Wetern blot檢測細(xì)胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白相對表達(dá)量：取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性，進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST溶液洗膜，分別加入1∶1 000稀釋的PTEN、PI3K、AKT、p-AKT和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、定影、拍照，分析各目標(biāo)蛋白條帶吸光度值，以目的蛋白條帶吸光度值與內(nèi)參β-actin條帶吸光度值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞耐藥對miR-216、PTEN mRNA表達(dá)的影響

L1210/DDP細(xì)胞中miR-26a mRNA表達(dá)明顯降低，PTEN mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)(表1)。

表1 細(xì)胞耐藥對miR-26a、PTEN mRNA表達(dá)的影響

2.2 轉(zhuǎn)染miR-26a對miR-26a、PTEN mRNA表達(dá)的影響

與NC組比較，耐藥組、抑制劑組miR-26a mRNA表達(dá)降低，PTEN mRNA表達(dá)升高，且抑制劑組miR-26a mRNA表達(dá)低于耐藥組，PTEN mRNA表達(dá)高于耐藥組(P<0.05)(表2)。

表2 轉(zhuǎn)染miR-26a對miR-26a、PTEN mRNA表達(dá)的影響

2.3 miR-26a靶基因驗證

生物信息預(yù)測顯示，miR-26a與PTEN存在連續(xù)結(jié)合位點(圖1)。

野生型NC組、野生型+miR-26a組、突變型NC組、突變型+miR-26a組相對熒光素酶活性分別為：(1.31±0.15)、(0.73±0.08)、(1.29±0.14)和(1.32±0.13)。與野生型+miR-26a組比較，野生型NC組、突變型NC組、突變型+miR-26a組相對熒光素酶活性顯著升高(P<0.05)。野生型NC組、突變型NC組、突變型+miR-21組相對熒光素酶活性無差異(圖1)。

圖1 miR-26a與PTEN的結(jié)合位點Fig 1 Binding site of miR-26a and PTEN

2.4 細(xì)胞抑制率及對DDP的IC50值比較

不同濃度DDP處理細(xì)胞后，耐藥組細(xì)胞抑制率降低，抑制組細(xì)胞抑制率升高(P<0.05)(圖2)。

圖2 細(xì)胞抑制率比較Fig 2 Comparison of cytostatic rate

對照組、NC組、耐藥組、抑制組細(xì)胞對DDP的IC50值分別為：(1.12±0.13)g/mL、(1.07±0.12)g/mL、(6.35±0.65)g/mL和(0.16±0.02)g/mL。與對照組、NC組比較，耐藥組細(xì)胞IC50值升高，抑制組細(xì)胞IC50值降低(P<0.05)；且抑制組細(xì)胞IC50值低于耐藥組(P<0.05)。對照組和NC組細(xì)胞IC50值無差異。

2.5 細(xì)胞凋亡率比較

對照組、NC組、耐藥組、抑制組細(xì)胞凋亡率分別為：(66.28±6.79)%、(64.68±6.64)%、(8.57±1.13)%和(84.26±8.45)%。與對照組、NC組比較，耐藥組細(xì)胞凋亡率降低，抑制組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，耐藥組細(xì)胞凋亡率低于抑制組(P<0.05)。

對照組、NC組細(xì)胞凋亡無差異(圖3)。

2.6 細(xì)胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白水平比較

與對照組、NC組比較，耐藥組、抑制組PTEN蛋白表達(dá)升高，PI3K蛋白表達(dá)及p-AKT/AKT降低(P<0.05)；抑制組較耐藥組PTEN蛋白表達(dá)升高，PI3K蛋白表達(dá)及p-AKT/AKT降低(P<0.05)(表3，圖4)。

表3 蛋白表達(dá)水平比較

A.control group; B.NC group; C.resistance group; D.inhibitior group圖3 細(xì)胞凋亡率比較Fig 3 Comparison of apoptosis rates

A.control group; B.NC group; C.resistancegroup; D.inhibitior group圖4 細(xì)胞中各蛋白表達(dá)Fig 4 Expression of various proteins in cells

3 討論

miRNA與血液腫瘤耐藥性關(guān)系密切，其通過調(diào)控靶基因表達(dá)，抑制或激活下游信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感度發(fā)生改變，引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，造成化療效果不佳甚至失敗。

miR-26a通過調(diào)節(jié)靶蛋白表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對藥物的敏感性，影響化療效果[6-7]。本研究中耐藥組細(xì)胞miR-26a mRNA表達(dá)較高，細(xì)胞抑制率和凋亡率較低，對DDP的IC50值維持在較高水平，抑制miR-26a表達(dá)后，細(xì)胞抑制率和凋亡率明顯升高，對DDP的IC50值明顯降低，提示過表達(dá)miR-26a可增強L1210/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。PTEN是體內(nèi)重要的抑癌因子，具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶雙重活性，在多種腫瘤中表現(xiàn)缺失或低表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[8]。PTEN可以作為miRNA的靶基因，參與人肺腺癌及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性[9-10]。本研究抑制組細(xì)胞中PTEN表達(dá)較耐藥組明顯升高，熒光素酶報告結(jié)果證實miR-26a與PTEN存在靶向性，提示抑制miR-26a可通過靶向上調(diào)PTEN，降低L1210/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。

PI3K/Akt信號通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要信號通路，在許多腫瘤組織中過度表達(dá)和活化，通過翻譯或轉(zhuǎn)錄水平引起腫瘤細(xì)胞失控性增殖，或下調(diào)腫瘤抑制蛋白p53的表達(dá)，還可抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。PI3K/Akt信號通路與腫瘤耐藥關(guān)系密切，過度活化的AKT通過抑制凋亡信號激酶活性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，與DDP、阿霉素多種化療藥物耐藥有關(guān)，嚴(yán)重影響化療效果，抑制PI3K/Akt通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥[11]。PTEN是PI3K/Akt通路的主要抑制分子，通過PI3K抑制下游AKT活化。抑制PTEN表達(dá)可以激活PI3K/Akt信號通路，介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性[12]。過表達(dá)PTEN通過抑制PI3K/Akt通路，增強胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的化學(xué)敏感性[13]。本研究抑制組PTEN蛋白顯著升高，PI3K、p-Akt蛋白水平顯著降低，提示上調(diào)PTEN可以抑制PI3K/Akt通路，miR-26a通過靶向調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)，進(jìn)而影響PI3K/Akt信號通路激活，從而使L1210/DDP細(xì)胞耐藥性發(fā)生改變。

綜上所述，L1210/DDP細(xì)胞中過表達(dá)miR-26a通過靶向抑制PTEN，激活PI3K/Akt信號通路，提高細(xì)胞對DDP的耐藥性，抑制miR-26a表達(dá)可以降低細(xì)胞耐藥性，體內(nèi)實驗尚需進(jìn)一步研究探討，以期為臨床治療CLL提供參考。