豬丁型冠狀病毒的分離鑒定

陳奕帆，邱文英，張麗燕，孫繼海，郝偉偉，嚴(yán)應(yīng)海

（1.華派生物工程集團(tuán)有限公司，四川 成都 641402；2.簡陽市十里壩街道辦事處社區(qū)事務(wù)服務(wù)中心，四川 簡陽 641400）

PDCoV（豬丁型冠狀病毒）屬于套式病毒目、冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型豬腸道病病原。PDCoV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長約25.4 kb，其構(gòu)成和排列順序?yàn)?'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-N-3'UTR[1-2]。其中，S基因編碼的S蛋白含有1 159或1 160個氨基酸殘基，以三聚體形式聚集于病毒囊膜的表面，主要參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合，同時也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白[3-4]。最早于2012年由Woo等從中國香港收集的豬糞便拭子中檢測到，隨后國內(nèi)研究學(xué)者賀東生等從嚴(yán)重腹瀉的新生仔豬小腸病料中檢測到PDCoV，且有證據(jù)顯示2004年前國內(nèi)不同地區(qū)的豬群中已存在PDCoV[2，5-6]。PDCoV可感染各種年齡段的豬群，但對新生仔豬的危害最大，感染率最高，引起的死亡率約為30%～40%[7]。感染仔豬臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐、脫水，剖檢病理結(jié)果顯示腸壁變薄，變透明，腸內(nèi)充斥著大量黃色液體，組織病理學(xué)變化主要見于空腸中、遠(yuǎn)端和回腸，十二指腸和空腸近端的病變不明顯，病變主要表現(xiàn)為腸絨毛上皮細(xì)胞萎縮、壞死，同時退化的腸上皮細(xì)胞進(jìn)入管腔[8]。PDCoV導(dǎo)致的臨床癥狀和病理學(xué)變化與豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）或豬傳染性胃腸炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE）相似，且常伴隨混合感染的情況，對于PDCoV的鑒別診斷需要借助實(shí)驗(yàn)室手段。

本研究利用特異性的RT-PCR方法對收集的6份病料進(jìn)行檢測，對確認(rèn)為PDCoV 陽性的病料進(jìn)行病毒的分離，并通過CPE、RT-PCR及S基因序列測定分析對分離的病毒進(jìn)行鑒定，旨在為進(jìn)一步開展PDCoV生物學(xué)特性研究和疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 病料及細(xì)胞

華派生物工程集團(tuán)有限公司2016年從四川某豬場采集到6份腹瀉仔豬小腸及內(nèi)容物樣本。豬睪丸（ST）細(xì)胞由華派生物工程集團(tuán)有限公司保管及供應(yīng)。

1.2 主要試劑

TRIzol?LS Reagent購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；MEM培養(yǎng)基購自GIBCO；新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程材料有限公司；PEDV、TGEV、PRoV（輪狀病毒）和PDCoV的特異性引物由華派生物工程研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法

2.1 病料的檢測

2.1.1 臨床病料處理 取少量小腸組織及內(nèi)容物置于1.5 mL離心管，加入適量的PBS，經(jīng)組織勻漿機(jī)勻漿處理制成20%（1∶5的重量體積比）組織懸液，反復(fù)凍融3次，離心收集上清液。

2.1.2 病料的RT-PCR檢測 參照TRIzol?LS Reagent試劑說明書提取病毒的基因組RNA，以提取的總RNA為模板，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成病毒cDNA。以cDNA為模板，配制PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，5 min；95 ℃，45 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30個循環(huán)；72 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳分析。

2.2 PDCoV-SCMS株的分離與鑒定

2.2.1 PDCoV陽性病料處理 取RT-PCR鑒定為PDCoV 陽性的小腸組織及內(nèi)容物，加入滅菌的PBS研磨，制成20%（1∶5的重量體積比）組織懸液，反復(fù)凍融3次后離心收集上清液，上清液用0.22 μm濾器過濾除菌。

2.2.2 PDCoV病毒的分離與傳代培養(yǎng) 取長成單層的ST細(xì)胞，倒掉細(xì)胞生長培養(yǎng)液，用PBS洗滌，加入過濾的上清液1.0 mL，置37 ℃吸附作用1 h后棄掉多余液體，加入含5 μg/mL胰酶的MEM維持液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。之后逐日觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)病變，無病變則在培養(yǎng)120 h后收獲，繼續(xù)進(jìn)行盲傳，直到出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，產(chǎn)生明顯病變的細(xì)胞收獲物在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代，當(dāng)細(xì)胞病變穩(wěn)定后進(jìn)行病毒蝕斑純化。重復(fù)進(jìn)行兩次蝕斑純化，保存病毒種子并記為F1代，在ST細(xì)胞中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

2.2.3 分離毒株的RT-PCR鑒定 根據(jù)2.1.2中操作方法，對蝕斑純化株F4代進(jìn)行RT-PCR檢測。

2.3 分離毒株的滴度測定

將分離毒株F5、F10、F15和F20代病毒液用含5 μg/mL胰酶的MEM維持液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個稀釋度病毒液，接種于長滿單層ST細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個滴度接種8孔，每孔接種100 μL，同時設(shè)正常細(xì)胞對照，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96 h，觀察細(xì)胞病變。

2.4 分離毒株的S基因序列測定

參考GenBank上收錄的豬丁型冠狀病毒基因序列（登錄號：MH715491.1），利用軟件針對S基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)4對特異性引物。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

參照TRIzol?LS Reagent試劑說明書提取F2代病毒的RNA，并利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成病毒cDNA。以cDNA為模板，配制PCR擴(kuò)增體系：2×PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，5 min；95 ℃，45 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1.5 min；30個循環(huán)；72 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行序列測定。

2.5 分離毒株的S基因序列分析

運(yùn)用 DNA Star 軟件中的 SeqMan 對擴(kuò)增的 4個基因片段測序結(jié)果進(jìn)行剪切拼接，獲得 SCMS株的S基因序列，再利用MegAlign將SCMS株的S基因序列與 GenBank 收錄的PDCoV參考毒株（表2）S基因序列進(jìn)行比對分析。

表2 參考毒株信息

3 結(jié)果

3.1 病料的檢測結(jié)果

利用實(shí)驗(yàn)室已有的 PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV 特異性引物對2016年四川某豬場腹瀉仔豬病料進(jìn)行 RT-PCR 檢測，檢出6號病料為單一感染PDCoV的陽性病料（圖1）。

圖1 6號病料RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.2 病毒的分離鑒定結(jié)果

3.2.1 病毒的分離 將處理后的6號病料上清液接種ST細(xì)胞，在盲傳至第5代時出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，在傳至第8代后出現(xiàn)了較規(guī)律穩(wěn)定的細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變大、變圓，繼而細(xì)胞融合、脫落。第10代病毒接種ST細(xì)胞后60 h開始出現(xiàn)蝕斑，隨時間增加蝕斑開始逐步變大，挑取直徑為1.0～2.0 mm、清亮的蝕斑，經(jīng)2次純化，所有蝕斑直徑大小基本一致。

3.2.2 分離毒株的RT-PCR鑒定結(jié)果 將蝕斑純化株F5代細(xì)胞毒進(jìn)行RT-PCR鑒定，擴(kuò)增出一條約865 bp的特異性目的條帶（圖2），表明試驗(yàn)成功從6號病料中分離到一株P(guān)DCoV，命名為PDCoVSCMS。

圖2 RT-PCR鑒定結(jié)果

3.2.3 TCID50的測定 分離株P(guān)DCoV-SCMS在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代，測定F5、F10、F15及F20代細(xì)胞毒的TCID50，培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞病變情況。按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，具體結(jié)果見表3。PDCoV-SCMS在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代，病毒滴度較穩(wěn)定。

表3 TCID50測定結(jié)果

3.3 S基因序列同源性分析

分離株P(guān)DCoV-SCMS的S基因包含3 480個核苷酸，與23個參考毒株之間的同源性為95.9%～98.5%，詳見圖3。PDCoV-SCMS分離株的S基因與美國、韓國、墨西哥分離毒株的同源性為96.8%～97.8%；與中國其他分離毒株的核苷酸同源性為97.1%～98.5%，其中與2018年山東分離株SD-11-2018同源性最高為98.5%；而與越南、泰國分離毒株的同源性最低，為95.9%～96.7%。

圖3 SCMS分離毒株與參考毒株S基因序列同源性比對

4 討論

自2012年Woo等首次從香港豬群中檢測到PDCoV以后，在美國、加拿大、墨西哥、韓國、泰國、越南等國家相繼出現(xiàn)了豬群感染PDCoV的報(bào)道[9-12]。2014年，在美國俄亥俄州PDCoV造成30%～40%仔豬死亡[13]。2015年，PDCoV在泰國某商品化豬場造成了母豬27.63%（829/3 000）的死亡率和仔豬64.27%（2 892/4 500）的死亡率[11]。同年7月，我國華南某規(guī)?；i場5～15日齡仔豬發(fā)生大規(guī)模嚴(yán)重腹瀉，發(fā)病率90%，造成的死淘率在90%以上，后經(jīng)RT-PCR鑒定均為PDCoV陽性[5]。PDCoV在世界各地的相繼暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過一些流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PDCoV在我國大陸的流行已較為普遍，且我國近年來感染率呈上升趨勢[15-17]。

豬腎小管上皮細(xì)胞（LLC-PK）、豬腎細(xì)胞（PK-15）及ST細(xì)胞是常用于PDCoV分離的細(xì)胞系，因此本試驗(yàn)利用ST細(xì)胞分離PDCoV。試驗(yàn)結(jié)果顯示，從四川某豬場PDCoV陽性病料中成功分離到一株P(guān)DCoV，將該病毒株命名為PDCoV-SCMS株。PDCoV-SCMS毒株能在ST細(xì)胞上穩(wěn)定增殖，形成典型的細(xì)胞病變，病毒滴度也較穩(wěn)定，S基因序列同源性分析顯示PDCoV-SCMS株與山東分離株SD-11-2018同源性最高為98.5%，與越南、泰國分離毒株的同源性最低。