蜜蜂蘭組培快繁技術(shù)體系的建立

饒寶蓉　劉忠輝　周先治　陳泳和

摘 要：為了篩選蜜蜂蘭組培快繁的最佳外植體以及蜜蜂蘭種子誘導(dǎo)增殖、生根的最佳培養(yǎng)基配方。以未成熟蒴果果莢、成熟略黃蒴果果莢（未裂開）、成熟至裂開蒴果果莢3種不同成熟度的蜜蜂蘭蒴果果莢作為外植體，研究不同成熟度果莢對蜜蜂蘭誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響;以MS為基本培養(yǎng)基及附加卡拉膠，采用四因素三水平正交試驗方法研究添加不同濃度6BA、NAA、IBA、活性炭、香蕉泥對蜜蜂蘭叢生芽誘導(dǎo)增殖的影響;以1/2MS為基本培養(yǎng)基及附加白糖、卡拉膠、香蕉泥，研究添加IBA、NAA、活性炭對蜜蜂蘭叢生芽生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：蜜蜂蘭以成熟且未開裂蒴果果莢作為外植體進行組培快繁表現(xiàn)最優(yōu)，其誘導(dǎo)時間短、誘導(dǎo)率高、感染率低，且生長情況良好。蜜蜂蘭叢生芽誘導(dǎo)增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+香蕉泥120 g·L-1+蔗糖35 g·L-1+卡拉膠7.0 g·L-1，增殖系數(shù)可達到3.1;生根壯苗最佳培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.9 mg·L-1+IBA 0.9 mg·L-1+香蕉泥120 g·L-1+蔗糖20 g·L-1+卡拉膠7.0 g·L-1，此培養(yǎng)條件下蜜蜂蘭根系粗壯整齊，其生根率可達100%。

關(guān)鍵詞：蜜蜂蘭;組織培養(yǎng);種子;增殖;生根

中圖分類號：S 682 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2021）03-0032-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.03.007

Abstract： In order to screen the best explant for the tissue culture and rapid propagation of Cymbidium floribundum Lindl.， and the best medium formula for the seed inducible proliferation and rooting of Cymbidium floribundum Lindl.， three kinds of capsule pods of Cymbidium floribundum Lindl. with different maturity were used as explants to study the effects of pods with different maturity on the inducing culture of Cymbidium floribundum Lindl. By using MS as the basal medium and adding carrageenan， the effects of different concentrations of 6BA， NAA， IBA， activated carbon and banana paste on the induction and proliferation of cluster buds of Cymbidium floribundum Lindl. were studied by orthogonal experiment with four factors and three levels. The effects of different hormone combination of IBA， NAA and activated carbon on the rooting culture of cluster buds of Cymbidium floribundum Lindl. were studied by using 1/2 MS as the basal medium and adding sugar， carrageenan and banana paste. The results showed that the fruit pods of mature and indehiscent capsules of Cymbidium floribundum Lindl. were the best explants for the tissue culture and rapid propagation， with short induction time， high induction rate， low infection rate and good growth. The optimal medium for the induction and proliferation of cluster buds of Cymbidium floribundum Lindl. was MS+6BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+banana paste 120 g·L-1+sucrose 35 g·L-1+carrageenan 7.0 g·L-1， and the multiplication coefficient reached 3.1. The optimal medium for the rooting and strong seedling was 1/2 MS basal medium+NAA 0.9 mg·L-1+IBA 0.9 mg·L-1+banana paste 120 g·L-1+sucrose 20 g·L-1+carrageenan 7.0 g·L-1. Under this culture condition， the root system of Cymbidium floribundum Lindl. was strong and neat， and the rooting percentage could reach 100%.

Key words： Cymbidium floribundum Lindl.; Tissue culture; Seed; Proliferation; Root

蜜蜂蘭Cymbidium Fioribundum Var.pumilum為蘭屬多年鱗莖蘭科附生植物，喜陰，怕陽光直射，喜濕潤，忌干燥，其葉革質(zhì)肥厚，并具有光澤，抗旱防寒力強。蜜蜂蘭花小，不香或微香，花雖小，但花序較大。每個花序上花朵數(shù)較多，又名多花蘭，花色為鮮艷的紅色，生長勢強健，能耐高溫和低溫。亦有較高的觀賞價值，是較理想的盆栽花卉之一。蜜蜂蘭主要分布于我國臺灣、福建、浙江、江西、湖南、湖北、四川、貴州、廣東、廣西、云南等地（北緯28°線以南各省均有分布）。生長于海拔300～1600 m的林緣樹干上或溪邊石壁上。多花蘭多數(shù)生長在山巖之上，也有的附生于大樹枝杈上。蜜蜂蘭不僅具有較高的觀賞價值還深受養(yǎng)蜂人的喜愛。蜜蜂蘭不僅外形酷似雌蜂，還能散發(fā)出獨特氣味吸引雄蜂前來交配，不僅為蘭花授粉，養(yǎng)蜂人可以利用此特性來幫助吸引野蜂，將其馴化為家養(yǎng)蜂，還可產(chǎn)純蜜蜂蘭蜂蜜。

蘭花主要以分株繁殖為主，繁殖系數(shù)低，自然條件下種子需要特定的真菌共生，萌發(fā)率極低[1]，蘭花種子萌發(fā)分為共生萌發(fā)和非共生萌發(fā)（無菌播種）兩種。其中非共生萌發(fā)是指在人工培養(yǎng)基上不需要任何真菌侵染就可以使蘭花種子萌發(fā)，它能夠在短期內(nèi)獲得大量幼小植株，是現(xiàn)階段經(jīng)濟有效的快速繁殖方法[2]，在蝴蝶蘭[3]、鐵皮石斛[4]、四季蘭[5]、帶葉兜蘭[6]等許多蘭花上的應(yīng)用報道較多，而在蜜蜂蘭的研究上較少。本研究以蜜蜂蘭不同成熟度蒴果果莢作為外植體進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，探究不同成熟度蒴果果莢作外植體對蜜蜂蘭組培快繁技術(shù)的影響，通過研究篩選蜜蜂蘭叢生芽誘導(dǎo)與增殖及生根培養(yǎng)基配方，建立蜜蜂蘭組培快繁技術(shù)體系，以期為蜜蜂蘭的組培快繁生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2018年在南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培室進行。

1.2 試驗材料

試驗材料為蜜蜂蘭蒴果，蒴果果莢采自南平市順昌縣洋墩鄉(xiāng)洋坑村，將果莢分為3類：未成熟蒴果果莢、成熟略黃蒴果果莢（未裂開）、成熟至裂開蒴果果莢。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同成熟度蜜蜂蘭蒴果消毒處理 取蜜蜂蘭完好蒴果，稍用流水沖洗，用一定濃度的洗潔精浸泡10 min左右，繼續(xù)用流水沖洗干凈，將蒴果轉(zhuǎn)入超凈工作臺，先用75%酒精消毒20～40 s，用無菌水沖洗2次，再用0.1%HgCl2消毒8 min，用無菌水沖洗5次，用濾紙吸干水分，放入無菌盤子上用刀片將其剝開，將種子用適量蒸餾水稀釋，后用膠頭滴管吸取滴入無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面[7-9]。取蜜蜂蘭成熟至開裂的蒴果，直接放置超凈工作臺上將蒴果內(nèi)的粉末狀種子撥至無菌濾紙上，然后將其包好，將包好的種子帶濾紙放置無菌瓶內(nèi)用75%酒精消毒20～40 s，用無菌水沖洗2次，再用0.1%HgCl2消毒8 min后，用無菌水沖洗5次，盡量輕輕搖晃，以免濾紙破損。消毒結(jié)束后用鑷子打開濾紙將種子用適量蒸餾水稀釋，后用膠頭滴管吸取滴入誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，2周左右，當看到由原來的黃色粉末狀種子未被感染且開始轉(zhuǎn)為綠色小原球莖時，即無菌系建立，可用于進一步試驗。

1.3.2 叢生芽誘導(dǎo)與增殖 通過無菌體系建立獲得的無菌芽，經(jīng)過繼代轉(zhuǎn)接，獲得一定數(shù)量的叢生芽作為增殖培養(yǎng)試驗材料。叢生芽增殖采用四因素三水平L9（43）正交試驗設(shè)計，選擇MS基本培養(yǎng)基，以6BA、NAA、活性炭、香蕉泥為試驗因素，代號為A、B、C、D，各因素取3個水平（表1），各處理培養(yǎng)基均附加卡拉膠7.8 g·L-1 。每個處理接種9瓶，每瓶接種10個誘導(dǎo)芽，3次重復(fù)。增殖培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計叢生芽增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種數(shù)）。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將獲得的健壯叢生芽切割成單芽（芽大小為1.5～2.0 cm），并接種于生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，附加白糖20 g·L-1、卡拉膠7.8 g·L-1、香蕉泥120 g·L-1。添加不同含量NAA（0.3、0.6、0.9 mg·L-1）和IBA（0.3、0.6、0.9 mg·L-1）及活性炭（0、0.6 g·L-1），其組合見表2，共12個處理，每個處理9瓶，每瓶接種10株，3次重復(fù)，生根培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況。

1.2.4 培養(yǎng)方式與培養(yǎng)條件 采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值5.6～5.8，在溫度為121℃，壓強131 kPa下滅菌22 min。培養(yǎng)基放置無菌室內(nèi)備用，1周后無感染即可使用。材料接種后，在光照強度2500 lx左右的光照下培養(yǎng)，光照時間11 h·d-1，培養(yǎng)室溫度保持（25±1）℃。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用Excel、正交設(shè)計助手V 3.1以及JMP軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度果莢對蜜蜂蘭誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

蘭科種子在野外難萌發(fā)不僅是因為種子本身需要經(jīng)過漫長時間的成熟轉(zhuǎn)化，還與環(huán)境因子如氧氣、水分、光照、溫度等以及共生菌有關(guān)[10]。從表3可以看出， 不同成熟度果莢對蜜蜂蘭誘導(dǎo)培養(yǎng)有一定影響，以成熟且未開裂的蒴果果莢表現(xiàn)最優(yōu)，其誘導(dǎo)時間短、誘導(dǎo)率高、感染率低，且生長情況良好。成熟裂開的果莢次之，在誘導(dǎo)時間上長于未裂開的果莢，且誘導(dǎo)率降低，這可能與種子直接接觸滅菌劑有一定的關(guān)系。而未成熟的蒴果表現(xiàn)較差，誘導(dǎo)時間長，轉(zhuǎn)類原球莖的數(shù)量少，時間長，不宜作為蜜蜂蘭組織培養(yǎng)的外植體。

2.2 不同因素對蜜蜂蘭試管苗增殖的影響

芽的增殖是組培快繁的重要環(huán)節(jié)，增殖率影響增殖效率。如表4，從K值大小可以看出，在蜜蜂蘭叢生芽增殖培養(yǎng)過程中，6BA對蜜蜂蘭叢生芽增殖的影響作用最大，添加活性炭不利于蜜蜂蘭叢生芽的增殖，以不添加為宜;NAA 添加量以0.15 mg·L-1為宜，香蕉泥對蜜蜂蘭叢生芽增殖也有一定的影響。從極差R值大小可以看出，不同因素對蜜蜂蘭叢生芽增殖影響的主次關(guān)系為A>C>B>D，這表明四因素對蜜蜂蘭叢生芽增殖影響最大的是6BA，其次是活性炭，再次是NAA和香蕉泥添加量，其中活性炭濃度較高對增殖不利。因此，活性炭應(yīng)控制在較低濃度或者以不添加為宜。叢生芽增殖最佳處理組合是A2B2C1D2。即MS培養(yǎng)基+6BA 2 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+香蕉泥120 g·L-1，45 d后蜜蜂蘭叢生芽增殖系數(shù)可達3.0以上。

從表5可知，6BA、NAA、活性炭和香蕉泥四因素中只有6BA顯著影響蜜蜂蘭叢生芽增殖系數(shù)，NAA、活性炭和香蕉泥對增值系數(shù)的影響未達到顯著水平，從F比可以看出影響程度最大的為6BA，與極差分析結(jié)果一致。

2.3 添加NAA、IBA、活性炭對蜜蜂蘭試管苗生根培養(yǎng)的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑NAA 、IBA對試管苗根的誘導(dǎo)有調(diào)控作用，在一定程度上影響著組培苗的生根時間、根系數(shù)量和瓶苗生長情況等。從表6可看出，在MS基本培養(yǎng)基中單獨添加生長調(diào)節(jié)劑NAA或者IBA的生根效果不及兩者混用的效果好。處理1、2、3（單獨添加NAA 0.3、 0.6、 0.9 mg·L-1）蜜蜂蘭根的生長勢隨著NAA濃度的增加而逐漸遞增，平均生根系數(shù)為1.20～1.93，生根率也逐漸遞增（91%～98%），地上部分苗的高度也逐漸增高。處理4、5、6（單獨添加IBA 0.3、0.6、0.9 mg·L-1）蜜蜂蘭根的生根系數(shù)隨著IBA濃度的增加略有所下降，但差異不顯著，生根率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，地上部分的高度也呈先升高后降低，根粗度逐漸增大。當同時添加NAA、IBA時各指標都優(yōu)于單一激素的指標，如處理7、8、9?？梢妰煞N激素對蜜蜂蘭生根起著協(xié)同作用。添加活性炭處理對蜜蜂蘭生根有負面影響，這可能與活性炭的吸附性有關(guān)。本研究結(jié)果表明，蜜蜂蘭生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+NAA 0.9 mg·L-1+IBA 0.9 mg·L-1+香蕉泥120 g·L-1。

3 結(jié)論與討論

本研究初步建立了一套較完整的蜜蜂蘭組織培養(yǎng)快速繁殖體系。目前有2000多種作物均可用組織培養(yǎng)獲得其再生植株的途徑，而用成熟的蒴果消毒后進行無菌播種形成原球莖，并經(jīng)過增殖分化發(fā)育成完整植株是蘭科屬用的方法較為多的一種，也可以選擇適宜的外植體（莖段、莖尖、幼芽、葉片等）誘導(dǎo)形成擬原球莖或者叢生芽來實現(xiàn)快繁易解決作物資源緊缺問題。組織培養(yǎng)的生長過程主要受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素的共同影響，其中激素種類和濃度至關(guān)重要[11-12]。本試驗分別用不同成熟度的蒴果果莢作為外植體，探究不同成熟度果莢對蜜蜂蘭誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果表明未成熟的蒴果果莢內(nèi)種子成熟度不夠，萌發(fā)時間長，誘導(dǎo)率低;而成熟開裂果莢在消毒滅菌上更難操作，且果莢內(nèi)的種子直接與滅菌劑接觸使得種子容易受傷，導(dǎo)致誘導(dǎo)率下降，萌發(fā)時間增長，因此蜜蜂蘭以成熟但果莢完好不開裂蒴果果莢作為外植體為佳。

本研究還設(shè)置激素不同濃度對已萌發(fā)的原球莖的分化、增殖和生根壯苗的影響，篩選出適合蜜蜂蘭誘導(dǎo)增殖與生根的培養(yǎng)基配方。不同學(xué)者在蘭科作物組織培養(yǎng)中所用生長素的種類和濃度不同，唐桂香等

[13]研究表明，MS基本培養(yǎng)基中添加6BA 1.0 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1有利于鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MS基本培養(yǎng)基中添加6BA 2.0 mg·L

-1和NAA 0.15 mg·L-1有利于蜜蜂蘭原球莖的誘導(dǎo)增殖，而1/2MS基本培養(yǎng)基中添加NAA 0.9 mg·L-1和IBA 0.9 mg·L-1有利于蜜蜂蘭原球莖的生根培養(yǎng)。

蘭科作物果莢內(nèi)種子數(shù)量極多，快速繁殖可利用該一優(yōu)勢，利用種子進行非共生萌發(fā)，繼而不斷進行分化和增殖。本試驗結(jié)果表明選用成熟且未開裂的蒴果果莢作為外植體最為理想，感染率低，萌芽率最高。適合蜜蜂蘭種子誘導(dǎo)增殖的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+6BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+香蕉120 g·L-1+蔗糖35 g·L-1+卡拉膠7.0 g·L-1，增殖系數(shù)可達3.1;適合蜜蜂蘭生根壯苗的培養(yǎng)基為1/2 MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.9 mg· L-1+ IBA 0.9 mg·L-1+香蕉泥120 g·L-1+蔗糖20 g·L-1+卡拉膠7.0 g·L-1，根系粗壯整齊，其生根率達100%。在試管苗培育成功后，關(guān)鍵問題是試管苗的移栽環(huán)節(jié)，如何提高試管苗移栽的成活率將是下一步的研究方向。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）