水稻胚特異表達(dá)基因Os08PTS啟動(dòng)子的克隆及分析

顏靜宛　林智敏　周淑芬　陳子強(qiáng)

摘 要：為分析編碼磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白基因Os08PTS在水稻種子發(fā)育中的功能及利用Os08PTS啟動(dòng)子進(jìn)行遺傳改良。依據(jù)TDNA插入位點(diǎn)信息，克隆Os08PTS基因啟動(dòng)子，并利用生物信息學(xué)手段分析Os08PTS啟動(dòng)子的順式作用元件特征，同時(shí)構(gòu)建啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植株，驗(yàn)證啟動(dòng)子的表達(dá)特征。結(jié)果表明：Os08PTS基因啟動(dòng)子片段中包含啟動(dòng)子的基本元件TATAbox和CAATbox，以及光調(diào)控元件、赤霉素應(yīng)答元件、生長(zhǎng)素反應(yīng)元件、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件等多個(gè)與生長(zhǎng)發(fā)育或者逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，還含有與分生組織表達(dá)以及胚乳表達(dá)相關(guān)元件等。進(jìn)一步構(gòu)建Os08PTS啟動(dòng)子的GUS融合載體，并獲得水稻遺傳轉(zhuǎn)化植株。Os08PTS啟動(dòng)子序列能夠驅(qū)動(dòng)Os08PTS基因在水稻莖和種子胚的表達(dá)，該啟動(dòng)子具有驅(qū)動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄的活性。

關(guān)鍵詞：水稻;啟動(dòng)子;GUS染色

中圖分類號(hào)：S 511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）03-0006-05

水稻是世界上重要的糧食作物之一，水稻胚的發(fā)育直接影響著整個(gè)植物體的繁殖和發(fā)育，因此備受研究者的關(guān)注。在分子水平上，水稻胚的發(fā)育是眾多基因在外界環(huán)境因子作用下有序表達(dá)的結(jié)果。啟動(dòng)子作為一種重要順式作用調(diào)控元件，在轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。根據(jù)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)的特點(diǎn)，可分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子三類[1]，其中胚特異性啟動(dòng)子具有顯著的組織特異性，可以調(diào)控內(nèi)外源基因在植物胚中特異性表達(dá)。因此，分離和鑒別水稻胚特異性啟動(dòng)子不僅有助于了解相關(guān)功能基因在胚中的作用，而且利用胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子可以使外源目的基因在胚中高效表達(dá)，同時(shí)避免因外源基因在植物其他部位的過(guò)度表達(dá)而產(chǎn)生對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的不良影響。

啟動(dòng)子捕獲是一種產(chǎn)生大規(guī)模隨機(jī)插入突變體庫(kù)的有力手段，廣泛應(yīng)用在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和植物中[2-4]。該方法利用無(wú)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因隨機(jī)插入染色體中，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因在生物體中的表達(dá)與否及表達(dá)部位，可以判斷報(bào)告基因插入位置附近是否有基因的啟動(dòng)子存在及其下游基因的表達(dá)特性，進(jìn)而通過(guò)報(bào)告基因插入位置可以分離出相應(yīng)的啟動(dòng)子及其基因。本課題組前期利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的水稻啟動(dòng)子捕獲突變體庫(kù)，獲得1個(gè)GUS報(bào)告基因在水稻胚中特異表達(dá)的突變體W8292，TailPCR分析顯示，該突變體的TDNA插入于1個(gè)編碼磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白（PITP）的基因內(nèi)，命名該基因?yàn)镺s08PTS。

本研究利用TDNA插入位點(diǎn)信息，克隆Os08PTS基因啟動(dòng)子，并利用生物信息學(xué)手段分析Os08PTS啟動(dòng)子的順式作用元件特征，同時(shí)構(gòu)建啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植株，驗(yàn)證啟動(dòng)子的表達(dá)特征，為進(jìn)一步分析編碼磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白基因Os08PTS在水稻種子發(fā)育中的功能及利用Os08PTS啟動(dòng)子進(jìn)行遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試啟動(dòng)子克隆材料和供試轉(zhuǎn)基因水稻受體材料均為明恢86。所有材料種植在福州壽山基地內(nèi)。

1.2 主要試劑

Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase高保真酶（諾唯贊公司），限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit（TaKaRa公司）、Golden Easy PCR System、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（天根生化科技有限公司），引物合成、DNA 測(cè)序（福州尚亞生物技術(shù)有限公司），組織培養(yǎng)試劑（Sigma公司），GUS染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 載體和菌株

供試菌株為大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌菌株EHA105，均購(gòu)于北京博邁德生物有限公司;啟動(dòng)子載體pCXGUSP為福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 Os08PTS啟動(dòng)子的克隆和生物信息學(xué)分析

前期獲得了水稻TDNA插入的基因Os08PTS在NCBI上的序列登錄信息（AP014964.1），根據(jù)Os08PTS基因上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，對(duì)照日本晴基因組序列設(shè)計(jì)Os08PTS啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增引物，引物編號(hào)及序列為P8292F1：5′gcaggagcccagaaacagca 3′

，P8292R1：5′ctaggttccccgtcttacaggct 3′。通過(guò)高保真酶PCR擴(kuò)增Os08PTS啟動(dòng)子序列。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s;95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 2 min，32個(gè)循環(huán);72℃，10 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳回收，產(chǎn)物預(yù)期大小為2000 bp。把條帶清晰、大小正確的PCR產(chǎn)物送至福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序正確的Os08PTS啟動(dòng)子序列，通過(guò)Plant CARE在線分析軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步對(duì)Os08PTS啟動(dòng)子的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，顯示出該序列的啟動(dòng)子序列特征。

1.5 啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)的載體構(gòu)建

將測(cè)序正確的Os08PTS啟動(dòng)子的回收產(chǎn)物加尾后，與pCXGUSP質(zhì)粒片段（Xcm I酶切回收）克隆，重組啟動(dòng)子載體名稱為PCXGUSOsP08PTS。用Bam HI單酶、Sca Ⅰ單酶、Hind Ⅲ單酶對(duì)重組啟動(dòng)子載體進(jìn)行酶切鑒定。挑選酶切條帶符合預(yù)期大小的正確單克隆，搖菌送福州尚亞生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證后獲得正確的Os08PTS

啟動(dòng)子載體電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

以明恢86的幼胚，經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，水稻愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)，抗性愈傷組織的篩選、分化及生根等相關(guān)的培養(yǎng)基和具體的試驗(yàn)步驟參照本實(shí)驗(yàn)室操作方法進(jìn)行

[5]。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

采用CTAB法提取水稻幼嫩葉片的DNA[6]。以提取的DNA為模板，設(shè)計(jì)潮霉素標(biāo)記基因的PCR引物，引物編號(hào)及序列為hyg1：TACACAGCCATCGGTCCAGA和

hyg2：TAGGAGGGCGTGGATATGTC，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 3 min;94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán);72℃，10 min。PCR產(chǎn)物大小為845 bp。

1.8 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色

將轉(zhuǎn)基因水稻苗和野生型水稻苗的根、莖、葉、穎殼、花藥、種子各組織取下，置于2 mL離心管中，加入配制好的GUS染色液，37℃孵育24 h。取出材料，轉(zhuǎn)入75%酒精中脫色2～3次，以便徹底清除葉綠素。樣本保存于75%酒精中，肉眼或者顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Os08PTS啟動(dòng)子的克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)Os08PTS基因上游2000 bp的啟動(dòng)子序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到1條長(zhǎng)2000 bp的片段（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，該序列長(zhǎng)度為2000 bp，與Genbank中預(yù)測(cè)的序列一致。進(jìn)一步分析Os08PTS啟動(dòng)子的順式作用元件，結(jié)果如表1所示，除了含有核心元件TATAbox和CAATbox外，該片段還含有與脫落酸相關(guān)元件ABRE，茉莉酸甲酯相關(guān)元件CGTCAmotif、TGACGmotif，赤霉素相關(guān)元件Pbox，光響應(yīng)相關(guān)元件AEbox、Box4、Gbox、GATAmotif、Ibox、Lbox，參與防御和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件TCrich repeats，生長(zhǎng)素反應(yīng)元件TGAelement，與分生組織表達(dá)相關(guān)元件CATbox，胚乳表達(dá)相關(guān)元件GCN4_motif等。這些順式作用元件的存在，說(shuō)明Os08PTS基因可能受光和多種激素的調(diào)控，還可能參與種子生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

2.2 啟動(dòng)子載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)2000 bp的Os08PTS基因上游啟動(dòng)子片段，加尾回收，通過(guò)TA克隆，連接到克隆載體PCXGUSP質(zhì)粒片段（Xcm I酶切回收）中。為了驗(yàn)證目的片段是否成功連接至載體上，對(duì)重組載體進(jìn)行單酶切檢測(cè)。根據(jù)PCXGUSP載體上的多克隆位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合Os08PTS啟動(dòng)子序列上的酶切位點(diǎn)，選用Bam HI酶、Sca Ⅰ酶、Hind Ⅲ酶分別對(duì)重組載體進(jìn)行單酶切鑒定，出現(xiàn)條帶大小分別為2000、1609和1115 bp的目的條帶，結(jié)果如圖2所示，這充分表明Os08PTS基因啟動(dòng)子已經(jīng)成功連接至PCXGUSP載體上。然后將酶切鑒定正確的重組載體送至尚亞公司測(cè)序，獲得含正確序列的目標(biāo)片段的重組啟動(dòng)子載體PCXGUSOsP08PTS（圖3）。采用電擊法將測(cè)序結(jié)果正確的重組啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織，獲得了轉(zhuǎn)化再生植株28個(gè)克隆。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

將分別提取的28個(gè)克隆水稻轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA作為模版，用PCR擴(kuò)增潮霉素基因，PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。從部分轉(zhuǎn)基因植株中擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明目的序列已經(jīng)整合到水稻基因組中。在28個(gè)克隆的水稻轉(zhuǎn)基因苗中，發(fā)現(xiàn)能擴(kuò)增出目標(biāo)片段大小的DNA條帶有27個(gè)克隆，而野生型水稻則不能擴(kuò)增出目的基因大小的條帶，轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率為96.4%。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色

從27個(gè)陽(yáng)性克隆水稻轉(zhuǎn)基因植株中隨機(jī)選取8個(gè)克隆進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的胚均能被GUS染色液染成藍(lán)色，而根、葉、穎殼、花藥和胚乳等其他組織器官均檢測(cè)不到藍(lán)色，這與啟動(dòng)子捕獲系突變體W8292的GUS表達(dá)特征類似，另外發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的莖也能呈現(xiàn)出藍(lán)色，而啟動(dòng)子捕獲系突變體W8292的莖沒(méi)有檢測(cè)到GUS活性（圖5），以上結(jié)果表明Os08PTS

上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)能驅(qū)動(dòng)下游基因在胚表達(dá)中表達(dá)，同時(shí)還具有在莖中表達(dá)的特征。

3 結(jié)論與討論

磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白（PITP）是指負(fù)責(zé)內(nèi)膜系統(tǒng)間磷脂運(yùn)輸?shù)牡鞍?，普遍存在于多?xì)胞動(dòng)物、真菌及高等植物中[7-9]。 研究表明，PITP在質(zhì)膜的運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的作用，參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌囊泡的形成、運(yùn)輸、磷脂酶C調(diào)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)酵母胞質(zhì)內(nèi)膜組分運(yùn)輸和脂類的代謝，以及參與高等植物發(fā)育過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)[10-12]，但目前對(duì)其功能的分子機(jī)制仍不是很清楚。Os08PTS基因是一個(gè)在水稻胚中特異性表達(dá)PITP基因，本研究對(duì)其上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)含有脫落酸、茉莉酸、赤霉素和生長(zhǎng)素等相關(guān)的順式作用調(diào)控元件，表明Os08PTS基因在水稻胚中的表達(dá)可能受多種激素的調(diào)控，該結(jié)果為進(jìn)一步研究Os08PTS基因在水稻胚中的調(diào)控作用提供了研究方向。

與組成型啟動(dòng)子相比，組織特異型啟動(dòng)子能減少外源基因表達(dá)產(chǎn)物的過(guò)度積累，不僅降低植物能量的浪費(fèi)而且對(duì)轉(zhuǎn)基因植株正常生長(zhǎng)的影響較小，因此在植物轉(zhuǎn)基因工程研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究對(duì)

Os08PTS基因上游2000 bp的啟動(dòng)區(qū)與GUS融合轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在莖和胚中特異表達(dá)，該結(jié)果與前期啟動(dòng)子捕獲突變體W8292中GUS的胚特異性表達(dá)不太一致。前人研究也有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象[13]，除了啟動(dòng)子長(zhǎng)度外，遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子、沉默子和絕緣子及基因本身的3′非翻譯區(qū)對(duì)基因表達(dá)特性均會(huì)產(chǎn)生影響[14]，具體原因需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）